论文摘要
背景和目的：利用FISH技术可在约20%-30%初治的多发性骨髓瘤（MM）中检测出1号染色体短臂2区1带的缺失（1p21）信号,且随着疾病进展,1p21缺发生率及阳性率明显增高,伴有1p21缺失的患者经大剂量化疗,生存期无明显延长,是独立的不良预后因素。经过基因数据库的筛选,我们发现hCDC14A基因参与中心体复制及细胞周期的调控。本课题组前期已经发现约40%的患者hCDC14A mRNA为低表达（结果尚未发表）。基于此,我们推测hCDC14A有可能参与MM的发病,本实验的目的在于进一步明确hCDC14A在MM中的作用及对于MM的一线治疗药物硼替佐米而言,该药能否参与对hCDC14A的调控。方法：第一部分：采集29例MM患者（24例初治,4例复发／难治,1例移植后）骨髓标本,Ficoll法分离骨髓单个核细胞,经CD138磁珠分选后,采用RQ-PCR法检测hCDC14A与p53基因mRNA的表达情况,并进行相关性分析。第二部分：1)采用Western-Blot法检测了我室保存的人骨髓瘤细胞系（HMCLs）表达hCDC14A蛋白；2)荧光共聚焦实验检测了hCDC14A蛋白在HMCLs中的表达和定位；3)给予不同浓度的硼替佐米（PS-341） （0、.6nM、5.2nM、10.4nM）分别处理U266、OPM-2和MM1.S 12h和24h,采用RQ-PCR法和Western-Blot法分别在mRNA水平和蛋白水平检测硼替佐米处理前后hCDC14A表达水平的变化；4)以2.6nM硼替佐米处理OPM-2细胞0h、3h、6h、9h和12h；以不同浓度硼替佐米（OnM、1.3nM、2.6nM、3.9nM和5.2nM）处理OPM-2细胞6h,以上药物分组处理后用Western-Blot法检测hCDC14A、P53和磷酸化P53（S315）蛋白表达的变化；5)为证明硼替佐米对于hCDC14A的调控是通过抑制NF/κB信号通路而发挥作用,本实验用EMSA法检测了不同浓度硼替佐米（0nM、2.6nM和10.4nM）作于用OPM-2细胞6h后,以及2.6nM硼替佐米处理OPM-2细胞6h和12h后,NF/κB活性的变化。分别用硼替佐米（2.6nM）、MG132（小分子蛋白酶体抑制剂）（500nM）和BAY 11-7082 （NF/κB通路抑制剂）（5μM）处理U266、OPM-2和MM1.S细胞12h后观察hCDC14A的变化；6)为进一步明确hCDC14A基因在MM中的作用,构建了重组pLKO.1-shRNA-hCDC14A’慢病毒载体,进行U266细胞的感染。结果：第一部分：对于所有29例患者而言,hCDC14A和P53 mRNA水平无统计学相关性（相关系数=0.351,P=0.062）；为除外因疾病状态不同这一混杂因素对结果造成影响,仅分析24例初诊患者,hCDC14A和p53 mRNA水平仍无相关性（相关系数=0.291,P=0.167）。第二部分：1)明确了我室保存的HMCLs中RPMI-8226、U266、OPM-2和LP-1为高表达hCDC14A的细胞；CZ-1、MM1.RL和MM1.S为低表达细胞,以此为基础,此后实验以U266、OPM-2和MM1.S为主要研究对象；2) hCDC14A蛋白可广泛定位于HMCLs的细胞核及细胞浆,部分细胞可见hCDC14A定位于中心体；3)硼替佐米能下调hCDC14A的表达,且该作用呈时间-剂量依赖性；4)硼替佐米下调hCDC14A同时S315位点磷酸化的P53蛋白表达水平上调；5)随着硼替佐米浓度的递增,OPM-2细胞中NF/κB活性的递减,2.6nM硼替佐米处理OPM-2细胞6h后NF/κB活性降低,但12h后NF/κB活性较6h时增强,同时NF/κB通路的抑制剂均可下调hCDC14A表达,提示硼替佐米是通过抑制NF/κB活性而对hCDC14A发挥负性调节作用。6)成功包装了慢病毒pLKO.1-shRNA-hCDC14A并进行了U266细胞的感染,目前正在进行阳性克隆的筛选中。结论：hCDC14A的缺失是否为1p21上真正参与MM发病机制的分子目前尚缺乏足够证据,但硼替佐米能通过抑制NF/κB信号通路对hCDC14A进行负性调控,提示hCDC14A有可能在MM的发病中起作用,需要进一步的功能实验进行验证。
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