核苷类抗HIV系列前药的化学稳定性及药物动力学研究

论文摘要

艾滋病是严重危害人类健康的全球性传染病。目前，医学界至今仍未成功研究出可以彻底治疗AIDS的方法。核苷逆转录酶抑制剂（NRTIs）一直是主导的抗AIDS药物，研究发展迅速。但NRTIs类药物的临床应用和药代动力学都有一定的缺陷，如d4T、AZT有临床毒性，在血浆中半衰期短（1小时），代谢差，易产生耐药性等。磷酸酯核苷类前药是近年核苷类药物结构修饰的一个重要方向。尽管在前药设计和合成方面有了很大的成功，但是验证前药机理的核苷释放问题仍然很少有过系统的研究。因此，本论文针对体外活性测试成功的前药，通过药物代谢动力学的研究来考察其能否在体内顺利地实现改善核苷利用的目的。本论文创新性地结合有机化学基础，分析化学手段，和临床前药物动物体内动力学研究，对具有优秀体外活性的化合物进行系统的筛选和评价，取得了以下的研究结果：1．对在体外抗病毒实验中显示了很高的抗HIV病毒活性(其抗HIV的IC50值是d4T的1000倍)的化合物，d4T-D-E，采用HPLC，31PNMR，HPLC／MS，ESI-MSn等综合手段进行体外化学稳定性研究，和水解代谢产物分析。论文发现d4T-D-E在不含酶的水溶液环境中，弱酸性环境有利于该化合物的化学稳定性，但酸性过大，也会加速它的水解；中性条件下有一定的半衰期（12．5小时）；碱性环境立即分解。在水解时，主要有三种可能的代谢途径。第一种为先水解断裂D，然后水解释放出核苷；第二种为直接水解释放出核苷；第三种，d4T-D-E被氧化，然后先水解断裂D，代谢为核苷d4T；或直接释放出核苷。2．论文建立了一种快速、灵敏的测定小鼠血浆中d4T，d4T-D-E浓度的液质连用定量方法（HPLC／MS／MS MRM法）。经过灵敏度，检测限，精密度和准确度，特异性，基质效应，稳定性确证，应用于d4T-D-E在小鼠体内动力学初步研究。3．论文通过对d4T-D-E的小鼠体内药物代谢动力学初步研究发现，灌胃给药d4T-D-E进入体内后，很快即代谢为d4T。这与d4T-D-E结构无法耐受体内的磷酸酯酶有很大关系，容易被磷酸酯酶催化分解为d4T和含磷组分。比较其主要药动学参数，相对于直接给药的d4T，d4T-D-E的消除相t1／2较短，相对口服生物利用度为40．31％，没有显示比未改造的核苷d4T更好的药动学性质。因此，该体外活性显著的药物由于不良的体内药动学结果而缺乏进一步临床开发的潜力。4．本论文采用一锅法合成了分别带有吸电子和推电子基团的六个AZT-5’-含磷衍生物。5．本论文建立了一种简单、快速、灵敏定量检测大鼠血浆中AZT-5’-含磷系列衍生物的HPLC-ESI-MS／MS MRM方法。对该方法进行灵敏度，检测限，精密度和准确度，特异性，基质效应，稳定性确证。将此法应用于该系列AZT-5’-含磷衍生物的动力学实验。6．本论文通过大鼠药物动力学实验，研究不同取代基系列化合物在体内的构效关系规律。发现不同取代基对AZT-5’-含磷衍生物的体内动力学有不同影响，吸电子和推电子基团的强弱是主导因素，或与相应酚的pKa大小有着直接的联系。吸电子基团衍生物在体内血浆中检测不到原药，代谢得到的AZT浓度较高。推电子基团衍生物在体内血浆中有一定的稳定性，能随着原药在体内的动力学运转变化，缓慢释放AZT，因此同时检测到原药和代谢物AZT。Y基供电子效应越强，化合物越稳定，在体内释放的AZT越持久，缓释的效果越好。7．本论文发现改造后的AZT-5’-含磷衍生物的药动学表现有很大提高，半衰期有不同程度延长（2．0-20．4倍），表观分布容积明显增大（0．6-20．7倍），平均驻留时间（MRT）增大3．1-40．5倍。修饰后的AZT-5’-含磷衍生物有缓释AZT的可能，能延长体内滞留时间，改进AZT在体内的药物水平，减少药物副作用。具有开发为临床抗HIV药物的潜能。M5能显著延长体内滞留时间，改进AZT在体内的药物水平，增加医疗效果。M3可能有一定的组织靶向性，并且从体内清除快。M4在血液中药物浓度高，吸收好。本论文的创新之处在于（1）充分利用了HPLC，31P NMR，HPLC／MS，ESI-MSn等现代分析技术，用于抗艾滋候选化合物d4T-D-E的体外化学稳定性研究，和水解代谢产物分析，提出了可能的水解途径；（2）运用液质连用定量方法（HPLC／MS／MS MRM法）进行药物代谢动力学研究，对抗艾滋候选化合物作临床潜能的深入筛选；（3）通过大鼠体内的动力学实验，研究化学结构和动力学表现间的联系，发现不同取代基对AZT-5’-含磷衍生物的体内药物动力学有不同影响，并提出可能的机理。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 引言
• 1.1 HIV/AIDS的传播形势
• 1.2 HIV的结构及致病机理
• 1.3 抗HIV药物
• 1.3.1 逆转录酶抑制剂
• 1.3.1.1 HIV-1 RT的结构功能
• 1.3.1.2 NRTIs/NtRTIs的作用机制
• 1.3.1.3 NRTIs/NtRTIs的发展现状
• 1.3.1.4 NRTIs类药物的临床应用
• 1.3.1.5 NRTIs类药物的药代动力学特点
• 1.3.2 蛋白酶抑制剂
• 1.3.3 HIV-1整合酶抑制剂
• 1.3.4 融合酶抑制剂
• 1.4 核苷类抗HIV新药的研发策略
• 1.4.1 结构类似物的研发
• 1.4.1.1 改变药物分子手性中心的构型
• 1.4.1.2 改变药物分子的取代基团
• 1.4.2 前药的研发
• 1.5 药物代谢动力学在药物研发中的作用
• 1.6 博士论文的工作目的
• 1.6.1 核苷类抗HIV前药d4T-D-E的化学稳定性及药物动力学
• 1.6.2 AZT -5'-含磷衍生物的大鼠体内动力学研究
• 参考文献
• 第二章 d4T-D-E的化学稳定性研究
• 2.1 实验部分
• 2.1.1 试剂与仪器
• 2.1.2 电喷雾电离质谱（ESI-MS）分析条件
• 2.1.3 高效液相色谱—质谱（RP-HPLC-ESI-MS）分析条件
• 2.1.4 d4T-D-E在RPMI-1640细胞培养液中的化学稳定性
• 2.1.5 d4T-D-E在人工模拟胃肠液中的化学稳定性
• 2.1.6 d4T-D-E在不同pH值缓冲液中的化学稳定性及水解产物解析
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 d4T-D-E的质谱裂解规律
• 2.2.2 d4T-D-E在RPMI-1640细胞培养液中的化学稳定性
• 2.2.3 d4T-D-E在人工模拟胃肠液中的化学稳定性
• 2.2.4 d4T-D-E在不同pH值缓冲液中的化学稳定性
• 2.2.5 d4T-D-E的水解产物分析及水解途径推测
• 2.2.5.1 d4T-D-E在pH=7.23缓冲液中的水解产物分析
• 2.2.5.2 d4T-D-E在pH=3.95缓冲液中的水解产物分析
• 2.2.5.3 d4T-D-E在自然水溶液中的水解产物分析
• 2.2.5.4 d4T-D-E在pH=10.13缓冲液中的水解产物分析
• 2.3 结论
• 参考文献
• 第三章 d4T-D-E在小鼠体内代谢动力学初步研究
• 3.1 引言
• 3.1.1 液质联用接口技术
• 3.1.2 液质联用的特点
• 3.1.3 液质联用在医药领域的应用
• 3.1.4 在药物动力学和药物代谢产物研究中的应用
• 3.1.5 液质联用在药物代谢产物结构鉴定中的应用
• 3.1.6 液质联用技术在药代动力学研究中的基质效应
• 3.1.7 离子阱质谱和三重四极杆质谱的比较
• 3.1.8 实验思路的设计
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 试剂与仪器
• 3.2.2 高效液相色谱—三重四级杆质谱分析条件
• 3.2.3 实验动物
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 小鼠血浆中d4T-D-E及d4T定量分析方法的建立
• 3.3.1.1 色谱条件的建立
• 3.3.1.2 质谱条件优化的步骤
• 3.3.1.3 质谱条件的确定
• 3.3.2 液质联用方法的确证
• 3.3.2.1 血液样品检测前处理方法
• 3.3.2.2 标准曲线的制备
• 3.3.2.3 方法专属性考察
• 3.3.2.4 回收率测定及基质效应考察
• 3.3.2.5 方法的精密度和准确度
• 3.3.2.6 样品稳定性考察
• 3.3.3 动物实验设计
• 3.3.4 d4T-D-E及d4T的动力学参数计算
• 3.4 结论
• 参考文献
• 第四章 AZT -5'-含磷衍生物的大鼠体内动力学研究
• 4.1 AZT -5'-含磷系列衍生物的合成
• 4.1.1 实验部分
• 4.1.1.1 试剂与仪器
• 4.1.1.2 电喷雾电离质谱（ESI-MS）分析条件
• 4.1.2 AZT -5'-含磷系列衍生物的合成
• 4.1.3 结果与讨论
• 4.2 大鼠体内动力学研究
• 4.2.1 实验部分
• 4.2.1.1 试剂与仪器
• 4.2.1.2 高效液相色谱—三重四级杆质谱分析条件
• 4.2.1.3 实验动物
• 4.2.2 液质联用定量分析方法的建立
• 4.2.2.1 色谱条件的建立
• 4.2.2.2 质谱条件的确定
• 4.2.3 液质联用方法的确证
• 4.2.3.1 血浆样品的处理
• 4.2.3.2 标准曲线的制备
• 4.2.3.3 方法专属性考察
• 4.2.3.4 提取回收率测定
• 4.2.3.5 方法的精密度和准确度
• 4.2.3.6 基质效应考察
• 4.2.3.7 样品稳定性考察
• 4.2.4 动物实验设计
• 4.2.5 动力学实验结果讨论
• 4.2.5.1 M1～M6在大鼠体内血药浓度变化规律
• 4.2.5.2 M1～M6化合物的动力学参数解析
• 4.2.5.3 AZT -5'-含磷系列衍生物的药物动力学结果
• 4.3 结果与讨论
• 4.4 结论
• 参考文献
• 第五章 结论
• 附录1 论文图表索引
• 附录2 论文中化合物的核磁、质谱谱图
• 博士期间发表的学术论文
• 致谢