腺病毒介导的TK/GCV基因系统联合肿瘤坏死因子-α治疗膀胱癌细胞的实验研究

论文摘要

研究背景和目的:膀胱癌是泌尿系最常见的恶性肿瘤之一,也是一个重要的公共卫生问题,世界上每年诊断的膀胱癌超过二十万例,每年约有一万两千人死于膀胱癌。在美国,为第4位最常见的恶性肿瘤,在我国,发病率位于泌尿生殖系统肿瘤的第一位。膀胱癌90%以上为移行上皮细胞癌（transitionalcell carcinoma of the bladder,TCC）,对放疗、化疗敏感性不高,治疗以手术为主,但是术后复发率较高,尤其是晚期肿瘤及有耐药性的原位膀胱癌,5年复发率约60%,15年复发率可达88%,其中10%—30%的复发肿瘤进展为浸润型,远期疗效不佳。特别是表浅性膀胱癌经尿道切除后的高复发率已经成为了治疗中亟待解决的问题。目前认为膀胱癌术后辅助治疗是治疗的关键,随着自杀基因（suicide gene）系统对膀胱癌治疗研究的逐步深入,大家逐渐认识到自杀基因系统是一种发展前景良好的治疗方法,TK/GCV系统是目前应用最广泛的自杀基因系统之一,TK/GCV通过表达胸苷激酶将无毒前药如丙氧鸟苷（ganciclovir GCV）磷酸化,作用于分裂期细胞,作为其底物掺入细胞DNA合成链并抑制细胞DNA聚合酶,使细胞DNA合成终止从而杀死细胞。国内外不少学者利用逆转录病毒或者腺病毒介导TK/GCV自杀基因系统进行各种肿瘤的治疗研究,作用效果明显。但是目前自杀基因系统存在着如基因转染效率低下,基因转导的靶向性差,各类载体及自杀基因本身对机体的毒性和损伤作用,载体及肿瘤细胞杀死后引发的自身免疫反应,前体药物代谢产物仅仅针对分裂期细胞等局限性。为了弥补自杀基因治疗系统的不足,越来越多的学者都在研究将现有的治疗方法和自杀基因治疗系统相结合,以寻找对抗膀胱癌复发的新思路和新途径。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是一种具有多种生物活性的细胞因子,尤其是对多种肿瘤细胞具有直接及间接的抑制和杀伤作用。在体外本身高浓度对肿瘤细胞产生细胞毒作用具有直接杀伤作用外,较低浓度时它能够通过诱导非增殖期细胞的凋亡而达到杀伤作用。在体内通过免疫调节作用诱导产生其他细胞因子（IL-1,IL-2,IFN-γ）增强免疫效应,并增强NK细胞、巨噬细胞的细胞毒性发挥抗肿瘤作用,同时能诱导肿瘤局部炎症反应,引起血液凝固局部组织缺血坏死等机制引起肿瘤坏死。TK/GCV基因系统联合TNF-α治疗膀胱癌的方法目前尚无相关报道。本实验采用TK/GCV系统联合小剂量TNF-α对鼠膀胱癌MB49细胞进行治疗,并对其体外、体内杀伤作用进行比较,探讨二者联合应用的治疗效果,为自杀基因联合细胞因子治疗膀胱癌提供一定的实验依据。方法:1、体外培养HEK293细胞及MB49细胞。2、使用含TK基因和绿色荧光蛋白（green fluorscent protein,GFP）基因的复制缺陷腺病毒（AdCMV-TK,Adv+）转染293细胞,扩增腺病毒。超速离心纯化腺病毒,用绿色荧光蛋白表达细胞计数测定腺病毒滴度。3、腺病毒感染膀胱癌MB49细胞,获取转染TK基因的MB49细胞。分别提取膀胱癌MB49细胞以及转染TK基因MB49细胞RNA,进行RT-PCR反应,电泳鉴定。4、在体外培养的已转染TK基因的MB49细胞的细胞培养液中加入不同浓度的GCV,GCV浓度为0、5、10、12.5、25、50、75、100、125μg/ml。在体外培养的MB49细胞的细胞培养液中加入不同浓度的TNF-α,TNF-α浓度为0、2.5、5、10、20、25、50、80、100μg/ml。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定药物作用细胞72 h后细胞存活率,确定GCV及TNF-α的有效作用浓度。5、根据以前的试验结果及前述实验所得GCV及TNF-α的有效作用浓度,选择对MB49细胞杀伤作用较小的药物浓度梯度（GCV取0、5、10、25、50μg/ml浓度,TNF-α取0、5、20μg/ml）分别加入GCV、GCV+TNF-α组作用已转染腺病毒MB49细胞,以正常MB49细胞为空白对照。采用MTT法测定各治疗组药物作用转染后膀胱癌细胞72 h细胞杀伤率。流式细胞仪（FCM）检测TK/GCV、TNF-α、TK/GCV+TNF-α组作用8 h后细胞凋亡情况。6、雌性C57BL/6小鼠30只,皮下注射浓度为1×107/ml MB49细胞PBS悬液0.1ml,2周后选取肿瘤大小约100 mm3鼠24只,随机分成4组,每组6只,第1组为对照组:MB49（注射PBS）;第2组为TNF-α组:MB49/TNF-α;第3组为腺病毒加GCV治疗组（TK/GCV）:MB49/（TK/GCV）;第4组为联合治疗组:MB49/（TK/GCV+TNF-α）。第3、4组分别进行瘤体内多点注射腺病毒,每次100μl,每天1次,连续3 d,第1、2组仅在瘤体内多点注射PBS每次100μl,每天1次,连续3 d。从第4天开始,第2、4组在瘤体周围皮下浸润注射浓度为100μg/ml TNF-α100μl,第3、4组腹腔内注射GCV 100 mg.kg-1第1组腹腔内及瘤体周围皮下分别注射PBS各在100μl,连续10 d。之后再观察2 d结束实验,测量各鼠肿瘤体积大小,并取出各组鼠肿瘤进行组织病理学检查。7、实验数据均以均数±标准差表示,采用SPSS13.0软件进行统计学分析（单向方差分析One-Way ANOVA及析因分析）,以P≤0.05有统计学意义。结果:1、293细胞能大量扩增腺病毒,纯化后腺病毒滴度为2×109PFU/ml。2、经RT-PCR扩增已转染腺病毒的MB49细胞出现大小为234 bp的TK基因片段,而未转染腺病毒的MB49细胞未扩增出相应片段,表明感染腺病毒的MB49细胞有TK基因mRNA表达。3、GCV作用72小时后转染腺病毒MB49细胞存活率随着GCV浓度的增高逐渐降低:GCV浓度为5μg/ml、25μg/ml、125μg/ml时细胞存活率分别平均为（96.97±1.67）%、（80.82±0.64）%、（28.15±1.61）%;TNF-α作用MB49细胞72小时后,细胞存活率随着TNF-α浓度增高而逐渐降低,TNF-α浓度为2.5μg/ml、20μg/ml、100μg/ml细胞存活率分别为（91.26±0.37）%、（54.69±2.63）%、（14.69±1.51）%。GCV对转染腺病毒MB49细胞及TNF-α对MB49细胞均有良好的抑制生长作用,且抑制作用的呈浓度依赖性。4、低浓度TNF-α联合时各个浓度GCV对细胞的杀伤率均较同浓度下单纯GCV对细胞的杀伤率有明显增强,且随TNF-α浓度增高联合治疗组杀伤效率增强。联合治疗组较单独应用TNF-α或GCV组统计学差异显著（P=0.00）,作用转染腺病毒MB49细胞72 h后,单纯50μg/ml GCV组杀伤率仅为（24.39±1.10）%,而50μg/ml GCV+5μg/ml TNF-α组及50μg/ml GCV+20μg/ml TNF-α组杀伤率分别为（40.05±0.97）%、（65.47±0.67）%,说明低浓度TNF-α能明显增强GCV对细胞的杀伤作用。流式细胞仪检测TK/GCV、TNF-α、TK/GCV+TNF-α组细胞均出现典型的sub-G1期凋亡峰,联合作用组凋亡率达（12.99±0.09）%较单独用药组（TK/GCV组为（6.66±0.13）%、TNF-α组为（7.76±0.12）%）有明显提高,统计学差异显著（P=0.000）。说明TK/GCV、TNF-α均能有效诱导凋亡,且二者均有协同作用。5、动物体内实验结束时对照组鼠肿瘤体积为171.52±4.33 mm3,单用TK/GCV、TNF-α组的肿瘤体积分别为93.43±2.10 mm3、53.95±2.61 mm3,这两组体积明显小于对照组（P=0.000）。而联合治疗组肿瘤体积为18.23±1.11mm3,明显小于前面3组（P=0.000）。6、组织病理学HE染色见各治疗组均出现细胞坏死凋亡,联合应用组较单独应用自杀基因及细胞因子效果好,仅于周边见少量活肿瘤细胞。结论:1、腺病毒载体能有效地将TK基因导入膀胱癌MB49细胞中表达;2、丙氧鸟苷（GCV）对转染TK基因的鼠膀胱癌MB49细胞能有效地杀伤,有剂量依赖关系;3、TNF-α在体外对鼠膀胱癌MB49细胞进有一定的杀伤作用,存在剂量依赖关系;4、TK/GCV自杀基因系统联合小剂量TNF-α能进一步促进体外鼠膀胱癌MB49细胞的凋亡;5、TK/GCV自杀基因系统联合小剂量TNF-α能增强自杀基因系统对体外鼠膀胱癌MB49细胞的杀伤作用;6、TK/GCV系统联合小剂量TNF-α能增强自杀基因系统对小鼠体内膀胱癌的治疗作用。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 第二章 材料与方法
• 第三章 实验结果
• 第四章 讨论
• 第五章 小结
• 第六章 参考文献
• 中英文缩略对照表
• 攻读学位期间成果
• 致谢