双生病毒卫星DNA与脉突和耳突症状相关的遗传决定因子研究

论文摘要

双生病毒/DNAβ病害复合体在自然寄主上能诱导不同的症状表型。烟草曲茎病毒（Tobacco curly shoot virus,TbCSV）/DNAβ在烟草和番茄上能引起曲叶症状,而中国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV）/DNAβ除引起曲叶外还引起寄主的脉突和耳突症状。为了确定症状差异的遗传决定因子,对TbCSV/DNAβ和TYLCCNV/DNAβ进行了假重组试验,结果表明脉突和耳突的表型是由TYLCCNV DNAβ决定的。DNAβ互补链上编码一个保守的ORF,即βC1,对TYLCCNV DNAβ的βC1的突变发现它编码一个症状决定因子,表达TYLCCNV DNAβ的βC1的转基因烟草产生曲叶、畸形和叶背面组织增生等发育异常的表型,而大部分转化TbCSV DNAβ的βC1基因的烟草和番茄植株均与正常植株类似,只有少数烟草表现出轻微叶上卷表型。为了进一步定位DNAβ上决定症状的遗传决定因子,利用Overlap Extension PCR的方法对两个卫星的βC1 ORF及其上游约430 nt的片段（包含A-rich区和βC1基因转录起始位点上游173 nt或200 nt的片段,简称为片段AP）分别进行了互换。构建嵌合体卫星的侵染性克隆,分别与辅助病毒TbCSV和TYLCCNV共同接种烟草和番茄。嵌合有TbCSV DNAββC1的TYLCCNV DNAβ丧失了诱导脉增厚和耳突表型的能力;嵌合有TYLCCNV DNAββC1或AP片段的TbCSV DNAβ也不能诱导植株产生典型的脉增厚和耳突。而嵌合TbCSV AP片段的TYLCCNVDNAβ则产生了耳突,但是耳突的数量减少、大小变小,并延迟产生。通过组织化学法和荧光光度法测定启动子的活性,发现TbCSV DNAββC1基因上游的全长片段拥有启动子活性,它能驱动GUS在转基因烟草中组成型表达。Southern印迹分析说明了所有嵌合体卫星均能系统侵染寄主植物,而且无论是辅助病毒还是卫星分子,其在植物体内的积累量与病害复合体引起的表型差异无关。上述结果表明,DNAβ编码的βC1蛋白对病害复合体TbCSV/DNAβ和TYLCCNV/DNAβ产生的症状差异起主导作用,但βC1的启动子也能影响症状诱导。对接种含TYLCCNV DNAββC1的PVX（PVX-Y10βC1）和PVX空载体的本氏烟植株分别提取RNA,进行miRNA芯片分析,结果表明,与杨树miR398b、番茄miR397、拟南芥miR397a以及拟南芥miR166a序列同源的miRNA积累量在两个样品之间存在显著性差异。Northern印迹结果验证了miR165/166同源物的积累量在表达TYLCCNV DNAββC1的本氏烟中特异性降低。这表明βC1有可能通过某种机制降低miRNA的量,减弱miRNA的有效切割,从而打乱植物的正常发育。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 目次
• 1 绪论
• 1.1 双生病毒科的分类、寄主范围及传播介体
• 1.2 双生病毒的基因组结构和功能
• 1.3 双生病毒的侵染过程
• 1.3.1 双生病毒的复制和转录
• 1.3.2 双生病毒的运动
• 1.4 双生病毒的致病相关因子
• 1.4.1 C4
• 1.4.2 C2/AC2
• 1.4.3 BC1
• 1.4.4 BV1
• 1.4.5 βC1
• 1.5 植物miRNA的研究进展
• 1.5.1 植物microRNA家族及其靶标的进化
• 1.5.2 植物中保守miRNA的系统发生分布
• 1.5.3 microRNA的生物合成
• 1.5.4 植物miRNA的作用模式
• 1.5.5 植物microRNA的靶标识别
• 1.5.6 植物microRNA介导的调控范围
• 1.5.7 miRNA在植物和病毒在对抗机制竞争中的作用
• 1.5.8 miRNA在植物抗病毒防御中的应用
• 1.5.9 RNA沉默抑制子影响miRNA代谢
• 2 TbCSV与TYLCCNV病害复合体症状差异的遗传决定因子定位
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 病毒和植物材料
• 2.1.2 菌株和载体
• 2.1.3 TbCSV-Y35DNAβ与TYLCCNV-Y10DNAβ4个嵌合体卫星构建
• 2.1.4 嵌合体分子的侵染性克隆构建
• 2.1.5 三亲交配及农杆菌接种
• 2.1.6 植物总DNA提取（CTAB法）
• 2.1.7 地高辛法Southern印迹检测
• 2.1.8 烟草的转化
• 2.1.9 番茄的转化
• 2.1.10 植物总RNA提取
• 2.1.11 northern印迹分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 TbCSV-Y35与TYLCCNV-Y10假重组实验
• 2.2.2 表达Y35βC1转基因植株的症状
• 2.2.3 嵌合体卫星诱导的症状类型分析
• 2.2.4 病毒DNA积累水平分析
• 2.3 讨论
• 3 烟草曲茎病毒卫星启动子的鉴定
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 植物总DNA的制备
• 3.1.2 载体构建
• 3.1.3 瞬间表达
• 3.1.4 转基因烟草的PCR鉴定
• 3.1.5 Northern blot分析
• 3.1.6 GUS活性的组织化学染色
• 3.1.7 GUS荧光活性分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 βC1ORF启动子表达载体的构建
• 3.2.2 瞬间表达中GUS活性的组织化学检测
• 3.2.3 瞬间表达中GUS荧光活性分析
• 3.2.4 转基因烟草的获得和分子鉴定
• 3.2.5 转基因普通烟中GUS活性的组织化学分析
• 3.2.6 转基因普通烟中的GUS荧光活性分析和Northern blot分析
• 3.3 讨论
• 4 TYLCCNV卫星DNA的βC1基因对植物miRNA积累影响的初步研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 SDS-PAGE电泳和Western印迹分析
• 4.1.3 miRNA芯片实验基本流程
• 4.1.4 小RNA获得和Northern印迹分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 Western印迹分析植株中βC1蛋白的表达
• 4.2.2 Microarray分析miRNA的差异表达
• 4.2.3 northern印迹验证特异的miRNA差异表达
• 4.3 讨论
• 5 全文小结
• 参考文献
• 附录A 常用生化及分子生物学试剂与仪器
• 附录B 常用缓冲液及培养基配方