论文摘要
CpG寡核苷酸（CpG oligodeoxynucleotide,CpG ODN）是一种细菌等微生物DNA广泛存在的、非甲基化胞嘧啶和鸟嘌呤核心序列及其特定侧翼序列构成的基序,具有强烈的免疫激活功能。CpG ODN不仅能有效激活天然免疫,而且能激活获得性免疫,尤其是细胞免疫,因此是一种很具潜力的新型免疫佐剂。 目前用于实验研究的CpG ODN多用人工方法合成,因成本太高而无法用于兽医临床。本研究从CpG ODN的实际应用出发,首先对含多拷贝免疫刺激性CpGODN的重组质粒pcDNAKCpG-1的遗传稳定性进行了系统的研究,将pcDNAKCpG-1转化菌在含卡那霉素的LB培养基上连续传30代,期间取不同代次的培养物进行质粒提取和序列测定,证明重组菌的质粒拷贝数、CpG ODN序列和卡那霉素抗性基因具有良好的稳定性。 采用自行设计的培养基配方和发酵程序对重组菌进行发酵培养,用自行设计的纯化方法进行重组质粒的大规模制备,然后将纯化的pcDNAKCpG-1以100μg/只和200μg/只两种不同剂量与禽流感灭活疫苗联合免疫试验鸡,分别于注射后第14、21、28、35、42天采集血清,用血凝-血凝抑制方法测定抗体效价,结果表明重组质粒能显著增强疫苗的免疫效果,可将抗体HI效价平均提高2倍,其合适的使用剂量为100μg/只。 根据农业转基因动物用微生物产品的安全评价要求,对含CpG ODN重组质粒的安全性进行了初步研究。为了提高质粒残留检测的敏感度和特异性,本研究从引物筛选、反应程序和反应体系三个方面对PCR检测方法进行了优化,优化后的方法可从100个鸡细胞中检测到一个拷贝的重组质粒。然后以150μg/只的剂量将重组质粒pcDNAKCpG-1经腿部肌肉注射试验鸡,定期采样提取组织基因组,采