论文摘要
造血细胞的起源一直是造血发育研究的热点和难点问题。其中一种观点认为造血细胞和内皮细胞起源于共同的前体细胞:血液血管干细胞（hemangioblast）。1997年Keller等在小鼠胚胎干细胞建立的BL-CFC（blast-colony forming cell）是最早证实该细胞存在的模型,目前已广泛应用于血液血管干细胞的发育调控研究。之后,Keller等在E7.5小鼠胚胎发现BL-CFC的存在。近期,我们的研究发现小鼠胚胎定向造血的起源部位AGM区亦存在类似血液血管干细胞的前体HPP-HA。然而,目前有关AGM区是否存在真正的BL-CFC仍然未知。本研究首先在小鼠胚胎AGM区建立了更精细的BL-CFC模型。取E9.5-E12.5小鼠胚胎AGM区,消化成单细胞后进行半固体集落培养。在bFGF、SCF、VEGF、IL-6、IGF-I和LIF等细胞生长因子的共同作用下培养3-5天后,可形成一种特殊形态的母细胞样集落,其形态和分化特征与小鼠胚胎干细胞来源的BL-CFC集落相似。将培养4-5天的集落转入液体扩增体系进行造血和血管的诱导分化,4天后收集单个集落来源的非贴壁细胞接种于造血祖细胞检测体系。结果表明:BL-CFC产生CFU-E、CFU-GM、CFU-Mix以及HPP的频率分别是100%、92%、92%和50%。同时,贴壁细胞换EGM2内皮细胞完全培养基继续进行诱导,10-15天时可见大量鹅卵石样内皮细胞以及成纤维样平滑肌细胞。随后进行内皮细胞特异性蛋白表达和体内、体外成血管功能检测,结果表明:贴壁细胞高比例的吞噬LDL,表达CD31和vWF等内皮细胞特异性表面标志,不表达CD45和F4/80等造血相关标志;表达血管平滑肌标志SMA和周细胞标志calponin;在体外Matrigel上可形成血管样结构,呈网络状生长;制备成Matrigel plug植入裸鼠皮下,可观察到外源性血管样结构,表明其具有体内成血管功能。而后,将野生型雄鼠（Sry+）和GFP+雌鼠（Sry-）胚胎AGM区细胞混合接种BL-CFC,随机挑取BL-CFC集落用PCR方法检测基因组DNA中Sry和GFP基因的存在。结果显示:所挑取的BL-CFC集落均表达单一标记（Sry或GFP）,证实了BL-CFC为单克隆源性。模型优化后发现:bFGF和SCF对于集落生长最重要,其次是IL-6。另外,我们还在脐动脉（与AGM区平行产生HSC的大血管）检测到BL-CFC的分布,而同期的胚胎循环血却未发现。进一步的实验发现:BL-CFC在脐动脉均匀分布于其胚胎近端和远端。因此,BL-CFC更可能是在脐动脉原位产生,而非通过血液或从背主动脉迁移而来。BL-CFC在AGM区发育动力学的研究结果表明:E9.5胚胎的BL-CFC含量为19±2, E10.5时达到高峰（125±8/胚胎）,之后逐渐下降,E12.5时为20±10/胚胎。之后对BL-CFC的空间分布进行了考察,结果表明:AGM区的BL-CFC几乎全部集中在AoM区。利用流式或磁珠分离AGM区细胞后进行BL-CFC培养,结果发现其全部集中在CD31+和Tie2+细胞亚群。为进一步研究小鼠胚胎AGM区血液血管干细胞的发育调控,我们用AGM区细胞体外孵育的方法考察了多种与造血发育相关的细胞生长因子,包括:IL-3、bFGF、IL-6、Epo、TPO、GM-CSF、SCF、OSM、VEGF等。结果表明:只有bFGF与IL-3可明显扩增AGM区的BL-CFC,前者扩增2.1±0.8倍,与已有文献一致;而IL-3的扩增作用较bFGF更强,为3.3±0.8倍。IL-3扩增BL-CFC的作用呈浓度依赖性,随着IL-3孵育浓度的增加,BL-CFC集落的数目逐渐增多;另外,随着AGM区细胞在体外孵育时间的延长BL-CFC数目会逐渐下降;而加入IL-3孵育6h时BL-CFC的数目就较0h有所扩增,12h扩增作用更加明显,24h后BL-CFC的数目已较0h组显著减少;另外,从总体分析,IL-3孵育后的BL-CFC数目均较与其同期孵育组显著增加。集落诱导分化的结果显示:IL-3孵育后BL-CFC的各系造血分化功能增强,贴壁细胞在体外Matrigel上形成的管的数目和长度均有所增加。另外,IL-3中和抗体可有效拮抗AGM区BL-CFC的发育,表明内源性IL-3在BL-CFC的发育中起重要作用。为考察IL-3是否也可调控原始造血发育,我们首先用RT-PCR检测各型IL-3受体在小鼠E7.5胚胎的表达情况。结果表明:与E10.5的AGM区细胞相似,IL-3的各型受体βC、βIL-3和IL-3Rα均表达于E7.5的胚胎细胞。体外孵育后发现:IL-3同样可扩增E7.5的各类造血CFC,其中:总CFC扩增4.7±0.8倍,而EryP-CFC、Mac-CFC和EPM-CFC的扩增倍数分别为4±1、6.9±2.8和5.6±1.2。此外,IL-3孵育后各系CFC的扩增倍数之间无显著差异,即:IL-3对原始造血各系CFC的扩增是非系特异性的。我们从增殖、凋亡和基因表达等多个方面初步考察了IL-3扩增胚胎造血发育的相关机理。应用流式细胞术发现:IL-3可以促进AGM区细胞的增殖,但并非特异性针对CD31+细胞群;同时,它还可抑制AGM区细胞包括CD31+细胞亚群的凋亡。实时定量PCR检测结果表明:IL-3可以改变AGM区和E7.5胚胎细胞的多个造血和内皮相关的基因表达。IL-3孵育E7.5胚胎细胞时可见Scl、Runx1、Gata-1和vWF的显著上调,而Flk-1的表达则下调;而IL-3孵育E10.5胚胎细胞后仅Scl和vWF的表达显著上调,而Flk-1和Runx1的表达显著下调。Western-blot检测发现IL-3可增加AGM区细胞STAT5和Erk1/2的磷酸化水平,且Jak2和MEK1/2的特异抑制剂AG490和PD98059分别可显著抑制IL-3对AGM区BL-CFC的扩增效应。上述结果表明:IL-3可通过JAK-STAT和MAPK信号通路发挥其调控BL-CFC的作用。总之,本研究在小鼠胚胎AGM区建立了经典的血液血管干细胞模型BL-CFC,并对其生物学特性进行了准确和细致的考察。应用上述模型,我们拓宽了对IL-3造血调控功能的认识,即:IL-3既可促进双向血液血管干细胞产生和分化,又可刺激早期胚胎原始造血。上述结论为今后优化胚胎干细胞造血和血管分化体系提供了有益的启示。