siRNA介导的Caveolin-1基因沉默对于FBJ-S1细胞的影响以及关于GD1a结合分子的研究

论文摘要

窖蛋白-1（Caveolin-1）是胞膜窖的一种基本结构成分,通常被认为是一种肿瘤抑制蛋白。胞膜窖与丝裂信号,肿瘤的生成以及转移都具有一定的联系。研究表明神经节苷脂GD1a可抑制小鼠骨肉瘤细胞系FBJ细胞的转移,并可诱导Caveolin-1的表达,为研究Caveolin-1在GD1a调控细胞转移的信号通路中的作用,我们使用siRNA技术在Caveolin-1表达量较高但转移性较差的FBJ-S1细胞中特异性的抑制Caveolin-1的表达。RT-PCR以及免疫印迹实验结果表明,在稳定转染Caveolin-1 siRNA的单克隆细胞中,siRNA对于Caveolin-1基因表达以及蛋白质合成最大抑制效果可达80%。创伤治愈（划痕恢复）实验结果显示,Caveolin-1表达量的降低可提高细胞的移动能力。通过WST法测定细胞存活度发现,正常培养条件下,Caveolin-1表达量的下调并未影响细胞增殖。但在无血清条件下,与对照细胞,Caveolin-1 siRNA转染的细胞存活率较高。使用二维电泳结合免疫印迹法对于去污剂不溶性成分（DIF）进行分离并分析发现,Caveolin-1 siRNA转染的细胞的DIF中,丝氨酸蛋白磷酸化明显增强,说明可能有细胞信号被诱发。通过对转然后细胞内其他一些分子基因表达水平的检测,发现Caveolin-1表达量下降后,肝细胞生长因子的表达显著升高,肝细胞生长因子是一种多功能的细胞因子,可诱导细胞移动,弥散并可提高肿瘤的侵袭和转移能力。而在转染Caveolin-1 siRNA的细胞中导入Caveolin-1 cDNA恢复Caveolin-1的表达水平后,发现肝细胞生长因子的表达量受到明显抑制。这项研究结果显示Caveolin-1在调控FBJ-S1细胞行为上有很重要的作用,并且为GD1a通过Caveolin-1抑制肿瘤转移这一理论提供了进一步支持。神经节苷脂参与如细胞生长,分化,凋亡以及转移等多种生物现象的调控。研究表明,神经节苷脂GD1a可通过调控MMP-9,Caveolin-1等与转移相关的关键分子来抑制FBJ细胞的转移。为进一步阐明GD1a调控肿瘤转移的机制,确定GD1a调控的下游分子,本次研究主要使用免疫沉淀法对GD1a可结合分子进行考察。通过免疫沉淀法并结合免疫印迹法,我们发现Caveolin-1存在于GD1a抗体沉淀复合物中。根据SDS-PAGE结果,一种分子量约为40kD左右的蛋白特异性的存在于GD1a抗体沉淀复合物中。使用二维电泳对于GD1a抗体沉淀复合物进行分离的结果显示,有两种分子量较低（15kD左右）,等电点偏酸性（约为4）的蛋白在由S1细胞裂解液中得到的GD1a抗体沉淀复合物中丰度较高,高于由LL细胞得到的。目前已经使用质谱分析鉴定出GD1a抗体沉淀复合物中存在的三种蛋白:actin,vimentin以及Stress-70 protein。针对GD1a抗体沉淀复合物中成分的进一步鉴定将有助于阐明GD1a调控肿瘤转移的分子机制。

论文目录

• Chapter Ⅰ.Effects of Caveolin-1 siRNA-mediated silencing of Caveolin-1 on mouse FBJ-S1 cells
• Abstract
• 摘要
• Introduction
• Materials and methods
• Results
• Discussion
• Chapter Ⅱ.Studies on GD1a-binding molecules as revealed by Immunoprecipitation
• Abstracts
• 摘要
• Introduction
• Materials and Methods
• Results and Discussion
• References
• List of my publications
• Acknowledgements