神经病理性疼痛中TNF-a诱生晚期炎性介质的机制研究

论文摘要

目的：1.观察在脂多糖激活原代培养大鼠小胶质细胞模型中,TNFα和HMGB1蛋白表达及TNFαmRNA和HMGB1mRNA表达的时间依赖性。2.观察NF-κB抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸（PDTC）和p38MAPK抑制剂SB 203580对体外TNFα诱导的原代培养大鼠小胶质细胞HMGB1蛋白表达及mRNA的影响。3.观察鞘内注射Etanercept对坐骨神经慢性挤压伤（CCI）大鼠痛阈和脊髓小胶质细胞活性、NF-κBp-p65、p-p38MAPK、HMGB1表达的调节,并探讨其临床疼痛治疗的机制。方法：1.用脂多糖（100ng/ml）刺激原代培养大鼠小胶质细胞,根据不同的指标设定取样时间点（Oh,2h,4h,6h,8h,12h,16h,18h,24h）,用ELISA法检测相应时间点细胞培养上清中TNFα和]HMGB1表达情况,用Western Blot检测细胞裂解液HMGB1表达情况,用RT-PCR检测TNFαmRNA和HMGB1 mRNA的表达。2.采用原代培养大鼠小胶质细胞,设立两部分,分别用PDTC和SB 203580处理。第一部分设立对照组、TNFα（25ng/m1）组、TNFa+PDTC组、PDTC组,第二部分设立对照组、TNFα组、TNFα+ SB 203580组、SB 203580组,均孵育16h后分别用ELISA法检测细胞培养上清中HMGB1表达情况、Western blot检测细胞HMGB1、NF-κBp-p65和p-p38MAPK表达情况,用RT-PCR检测HMGB1 mRNA表达。3.252只成年雄性SD大鼠,体质量250～300g,鞘内置管成功后,随机分为7组（n=36）：正常对照组：实验大鼠不做任何处置；假手术组：仅暴露左侧坐骨神经不结扎；假手术+Etanercept组：假手术处理大鼠并经鞘内置管注入Etanercept组；CCI组：大鼠CCI手术处理；CCI+Etanercept组。鞘内置管3d后按每组处理不同,开始鞘内输注生理盐水和Etanercept,每2d鞘内给药一次,鞘内注射2d后分别建立大鼠CCI神经病理性疼痛模型和假手术模型,测定大鼠的痛敏值,并在CCI后第3,7,13天处死大鼠,取脊髓腰膨大部进行免疫组化测定OX42表达、用Western Blot检测HMGB1、NF-κBp-p65和p-p38MAPK表达情况,用RT-PCR检测（?）HMGB1 mRNA表达。结果：1.LPS刺激后大鼠小胶质细胞形态呈巨噬细胞样变化;TNFα的分泌于8h达峰值,细胞内及细胞外HMGB1的分泌分别于18h和24h达峰值,TNFαmRNA的表达于2h即达峰值,HMGB1mRNA自8h开始增加,12h达峰值。2.TNFα刺激后大鼠小胶质细胞裂解液及上清液中均有HMGB1蛋白表达增高,PDTC可抑制TNFα诱导的NF-κBp-p65核表达,并下调HMGB1蛋白和HMGB1mRNA的表达；SB 203580可抑制TNFα诱导的p-p38MAPK表达（P<0.01）,同样下调HMGB1蛋白和HMGB1mRN的表达。3.CCI组与Sham组比较大鼠术后各时点痛敏阈值明显下降,并在术后第3d降至最低点（P<0.01）,脊髓OX42、p-p65、p-p38MAPK的表达明显升高（P<0.01）,HMGB1mRNA的表达从3d开始表达上调,7d达峰值,HMGB1蛋白表达于7d开始增加,持续增长至13d。Etanercept+CCI组与CCI组比较,术后各时点大鼠痛敏阈值增高,脊髓OX42、p-p65、p-p38MAPK、HMGB1的表达下降（P<0.01）。结论：1.LPS可激活小胶质细胞,改变细胞形态,增加细胞TNFα和HMGB1蛋白和mRNA的表达2.TNFα可增加小胶质细胞释放晚期炎症因子HMGB1蛋白和mRNA的表达,NF-κB和p38MAPK可能与其激活释放HMGB1的细胞信号分子机制有关。3.鞘内给予Etanercept可减轻CCI大鼠的病理性疼痛,并抑制脊髓小胶质细胞活性,下调p-p65、p-p38MAPK、HMGB1的表达,这可能是Etanercept治疗慢性神经病理性疼痛的机制之一。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 技术路线图
• 第一章 LPS诱导大鼠小胶质细胞早期及晚期炎症因子释放的研究
• 前言
• 1.1 材料与方法
• 1.2 实验方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 1.5 结论
• 第二章 TNFα诱导小胶质细胞释放HMGB1的机制研究
• 前言
• 2.1 材料与方法
• 2.2 实验方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 2.5 结论
• 第三章 依那西普治疗大鼠神经病理性疼痛的机制研究
• 前言
• 3.1 实验动物与材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 3.5 结论
• 全文总结
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间主要的研究成果