马铃薯病毒m-RT-PCR检测技术及试剂盒设计

论文摘要

马铃薯（Solanum tuberosum L.）是世界上第四大粮食作物,在我国和世界工农业生产中都占有十分重要的地位。我国是世界上最大的马铃薯生产国,2006年我国马铃薯种植面积达到490.15万hm2,总产量为7033.8万t,单产为14.35 t/hm2,接近于世界水平16.74 t/hm2,但远远低于发达国家平均单产34.41-45.33 t/hm2,马铃薯生产受到多种病虫害的制约,其中病毒是危害马铃薯生产的主要病害。马铃薯脱毒种薯生产、检测体系和推广应用体系的不健全是造成我国马铃薯单产水平低的主要原因,因此马铃薯种薯病毒检测体系亟待完善。本研究采用multiplex-RT-PCR（m-RT-PCR）的方法,根据各病毒的保守序列,设计特异性引物,建立了在同一PCR反应中同时检测六种马铃薯病毒（PVX,PVY,PVA,PVM,PVS,PLRV）和一种马铃薯类病毒（PSTVd）的反应体系,并保证反应体系的稳定性、重复性和准确性,主要研究结果如下:1.建立并优化了在同一PCR反应中能同时检测六种马铃薯病毒（PVX,PVY,PVA,PVM,PVS,PLRV）和一种马铃薯类病毒（PSTVd）的反应体系,确定其反应体系为10×PCR反应缓冲液2μl,2.5m mol/L MgCl2 1.5μl,2mmol/L dNTP 3μl,Taq酶1Unite,10μmol/L各种病毒特异性引物（PVX,PVS 0.3μl,PVY,PVM,PLRV,PSTVd 0.5μl,PVA 0.7μl）,模板2μl,总体积20μl;其反应条件为94℃5min,94℃45 sec,57℃45 sec,72℃1min 30sec,72℃10min,40个循环。2.分别用所建立的m-RT-PCR体系与双夹心抗体酶联免疫技术（DAS-ELISA）对T962-52,老龄洋芋,T962-27等20个马铃薯品种（系）的试管苗进行了PVX,PVY,PVA,PVM,PVS,PLRV和PSTVd的检测,比较m-RT-PCR与DAS-ELISA的检测结果发现,本研究所建立的马铃薯病毒检测的m-RT-PCR技术相对于DAS-ELISA技术而言,是一种更快速、更经济、更准确的病毒检测技术。3.构建了马铃薯主要病毒类病毒m-RT-PCR检测试剂盒,为m-RT-PCR的应用打下了基础。

论文目录

• 缩略词表
• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 课题的提出
• 1.2 研究进展
• 1.2.1 六种马铃薯病毒和马铃薯纺锤块茎类病毒概述
• 1.2.1.1 马铃薯Y病毒（PVY）
• 1.2.1.2 马铃薯X病毒（PVX）
• 1.2.1.3 马铃薯卷叶病毒（PLRV）
• 1.2.1.4 马铃薯S病毒（PVS）
• 1.2.1.5 马铃薯M病毒（PVM）
• 1.2.1.6 马铃薯A病毒（PVA）
• 1.2.1.7 马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）
• 1.2.2 马铃薯病毒检测方法概述
• 1.2.2.1 生物学法（指示植物鉴定法）
• 1.2.2.2 血清学法
• 1.2.2.2.1 夹心抗体酶联免疫反应DAS-ELISA
• 1.2.2.2.2 快速免疫滤纸测定法
• 1.2.2.2.3 免疫胶体金技术
• 1.2.2.3 植物病毒电镜诊断
• 1.2.2.3.1 负染色法
• 1.2.2.3.2 超薄切片法
• 1.2.2.3.3 免疫吸附电镜术
• 1.2.2.4 生物化学法
• 1.2.2.4.1 核酸分子杂交
• 1.2.2.4.2 反向聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 1.2.2.4.3 双链RNA电泳技术
• 1.2.2.4.4 聚合酶链式反应
• 1.3 本研究的目的及内容
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 马铃薯叶片RNA抽提纯化
• 2.2.2 m-RT-PCR特异性引物设计
• 2.2.3 确定最适的m-RT-PCR反应条件
• 2.2.4 反转录
• 2.2.5 PCR扩增
• 2.2.6 PCR产物检测
• 2.2.7 UNIQ-10柱式DNA片段回收
• 2.2.8 用氯化钙制备大肠杆菌感受态细胞
• 2.2.9 LB培养基的制备
• 2.2.10 A-T克隆
• 2.2.11 测序
• 2.2.12 双夹心抗体酶联免疫反应DAS-ELISA
• 3 结果与分析
• 3.1 单个病毒或类病毒PCR反应结果
• 3.1.1 总RNA的抽提
• 3.1.2 PVY,PVS,PVX,PLRV和PSTVd各病毒单个RT-PCR结果
• 3.1.3 PVA和PVM特异性引物的设计与筛选
• 3.1.4 PVA和PVM RT-PCR体系的初步建立与优化
• 2浓度、dNTPs浓度的优化）'>3.1.4.1 PVA单个PCR体系的优化（退火温度、MgCl₂浓度、dNTPs浓度的优化）
• 2浓度、dNTPs浓度的优化）'>3.1.4.2 PVM单个PCR体系的优化（退火温度、MgCl₂浓度、dNTPs浓度的优化）
• 3.2 各病毒PCR反应产物测序与确定
• 3.3 PVY,PVS,PVX,PLRV,PSTVd,PVA和PVM的m-RT-PCR反应体系的建立
• 3.3.1 总RNA抽提
• 3.3.2 m-RT-RCR扩增结果
• 3.4 m-RT-RCR反应体系的优化
• 3.5 各病毒单个PCR与m-RT-PCR反应结果比较
• 3.6 m-RT-PCR反应的灵敏度测验
• 3.7 m-RT-PCR与DAS-ELISA病毒检测特异性与准确性的比较
• 3.8 m-RT-PCR病毒检测试剂盒成分
• 4 讨论
• 4.1 总RNA抽提
• 4.2 PVA和PVM特异性引物的设计与筛选
• 4.3 PVA和PVM PCR体系的优化
• 4.4 m-RT-PCR体系的建立与优化
• 4.5 m-RT-PCR灵敏度分析
• 4.6 m-RT-PCR病毒检测试剂盒的研制及其应用前景分析
• 4.7 不足与展望
• 参考文献
• 附录1:DAS-ELISA检测PVY的结果
• 附录2:DAS-ELISA检测PVX的结果
• 附录3:DAS-ELISA检测PLRV的结果
• 附录4:DAS-ELISA检测PVS的结果
• 附录5:DAS-ELISA检测PVA的结果
• 附录6:DAS-ELISA检测PVM的结果
• 致谢