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微生物转化法制备普瑞巴林手性中间体

2020-12-24阅读(763)

微生物转化法制备普瑞巴林手性中间体

论文摘要

普瑞巴林（Pregabalin）,（S）-3-氨甲基-5-甲基己酸,是一种用于抗神经痛和癫痫症的辅助治疗的手性药物,其国际市场需求呈现较快增长之势。开展生物催化法制备普瑞巴林的研究,筛选拆分制备普瑞巴林的微生物,具有重要的应用前景和价值。（S）-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯（（S）-CCMAE）是合成普瑞巴林的关键手性中间体。本文首先以外消旋体2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯（CCMAE）为底物,从土壤中筛选得到一株具有自主知识产权的能够对映选择性水解（R）-CCMAE的假单胞菌（Pseudomonas） CGMCC No.4184。对其产酶条件及培养基进行了优化,使酶活从15.92 U/L提高到33.43 U/L。随后对假单胞菌CGMCCNo.4184静息细胞水解拆分底物的反应条件进行了研究,确定了较优反应条件为：30～35℃,pH 7.5-8.5。并成功利用微生物静息细胞转化法制备了ee值达99.8%的（S）-CCMAE,这与目前报道的生物拆分工艺均有所不同。研究还发现Tween-80和TritonX-100可明显提高对映选择率E值和酶活。最后利用海藻酸钠-PVA复合载体法制备了假单胞菌CGMCC No.4184的固定化细胞,对其技术参数和反应条件作了优化,并利用所制得的固定化细胞制备ee值99%以上的（S）-CCMAE。该固定化细胞能够较好地进行重复利用。本研究中筛选获得的高选择性R型水解酶可能是一种新酶,后续的基因克隆和表达、酶学性质研究工作正在进行中,为进一步改善酶的催化性能和拓展应用范围打下了良好的基础。

论文目录

  • 致谢
  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 文献综述
  • 1.1 绪论
  • 1.1.1 普瑞巴林
  • 1.1.2 普瑞巴林的市场前景
  • 1.2 国内外研究进展
  • 1.2.1 不对称合成法
  • 1.2.2 外消旋体拆分法
  • 1.2.3 普瑞巴林制备方法的比较
  • 1.3 本课题的研究意义
  • 1.4 本课题的研究意义
  • 1.5 本课题的研究思路和内容
  • 第二章 选择性水解CCMAE菌种的筛选及鉴定
  • 2.1 前言
  • 2.2 实验材料
  • 2.2.1 土壤样品来源
  • 2.2.2 培养基
  • 2.2.3 试剂
  • 2.2.4 仪器
  • 2.3 菌种筛选
  • 2.3.1 筛选方法
  • 2.3.2 土样采集
  • 2.3.3 富集培养
  • 2.3.4 菌种的分离纯化
  • 2.3.5 菌种初筛
  • 2.3.6 菌种复筛
  • 2.4 菌株鉴定
  • 2.5 分析及计算方法
  • 2.5.1 分析方法
  • 2.5.2 转化率、ee值和对映体选择率E的计算方法
  • 2.6 结果与讨论
  • 2.6.1 菌株筛选结果
  • 2.6.2 菌株鉴定结果
  • 2.7 本章小结
  • 第三章 菌株产酶条件的优化
  • 3.1 前言
  • 3.2 材料与方法
  • 3.2.1 培养基组成
  • 3.2.2 仪器试剂
  • 3.2.3 培养条件
  • 3.2.4 有效产酶部位的确定
  • 3.2.5 酶活定义及测定
  • 3.2.6 产酶条件优化
  • 3.2.7 静息细胞转化底物
  • 3.3 结果与讨论
  • 3.3.1 有效产酶部位的确定
  • 3.3.2 温度与初始pH对产酶的影响
  • 3.3.3 不同碳源、氮源和金属离子对产酶的影响
  • 3.3.4 Plackett-Burman试验
  • 3.3.5 最陡爬坡试验
  • 3.3.6 响应面法优化产酶条件
  • 3.3.7 优化后假单胞菌CGMCC No.4184的生长-产酶曲线
  • 3.3.8 静息细胞法拆分底物CCMAE的初步研究
  • 3.4 本章小结
  • 第四章 目标菌选择性水解CCMAE反应条件的研究
  • 4.1 前言
  • 4.2 材料与方法
  • 4.2.1 培养基组成
  • 4.2.2 仪器试剂
  • 4.2.3 培养条件
  • 4.2.4 静息细胞法转化底物
  • 4.2.5 酶活定义及测定
  • 4.3 结果与讨论
  • 4.3.1 温度和pH对拆分效果的影响
  • 4.3.2 不同表面活性剂剂和共溶剂对拆分效果的影响
  • 4.3.3 不同底物浓度对拆分效果的影响
  • 4.3.4 游离细胞稳定性研究
  • 4.4 本章小结
  • 第五章 固定化细胞拆分CCMAE的初步研究
  • 5.1 前言
  • 5.2 材料与方法
  • 5.2.1 培养基组成
  • 5.2.2 仪器试剂
  • 5.2.3 培养条件
  • 5.2.4 固定化细胞制备方法
  • 5.2.5 酶活测定
  • 5.2.6 机械强度测定
  • 5.3 结果与讨论
  • 5.3.1 不同固定化方法的比较
  • 5.3.2 游离细胞与固定化细胞的比较
  • 5.3.3 海藻酸钙-PVA复合载体制备固定化细胞的条件优化
  • 5.3.4 固定化细胞转化条件的初步优化
  • 5.3.5 固定化细胞的反复批式试验
  • 5.4 本章小结
  • 第六章 结论与展望
  • 6.1 结论
  • 6.2 建议
  • 参考文献
  • 作者简历

    • 相关论文文献

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