蓝光对人视网膜色素上皮复制衰老细胞内趋化因子mRNA表达的影响

论文摘要

目的:蓝光光照可以引起人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞发生视网膜光损伤。研究发现,紫外光（ultraviolet,UV）可以引起牛RPE细胞复制衰老。蓝光和紫外光对RPE细胞有类似的损伤,本研究目的在于观察蓝光能否诱导人RPE细胞发生复制衰老及蓝光对细胞内趋化因子信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid,mRNA）表达的影响,探讨复制衰老与人RPE细胞内趋化因子的关系,为探讨蓝光损伤、复制衰老及炎症在老年性黄斑变性（age-related macular degeneration,AMD）发病机制方面提供理论根据。方法:1.取意外死亡的健康成年男性眼球,作角膜移植后,采用胰蛋白酶消化法培养人原代RPE细胞,观察细胞的生长状况及特性,免疫组化鉴定细胞来源。2.将细胞分成实验组和对照组,实验组细胞培养瓶置于蓝光发光二极管（lightemitting diode,LED）光源下照射,对照组用黑纸完全包裹培养瓶,继续培养。3.将各组细胞的第3代到第5代,消化后调整细胞密度为2×105个/ml,接种于24孔板培养24小时,进行衰老相关-β半乳糖苷酶（senescence associatedbeta-galactosidae,SA-β-Gal）活性的检测。高倍镜下观察细胞内是否有蓝色颗粒的表达,随机选取5个视野计数阳性细胞数目。4.将各组细胞的第3代到第5代,消化后调整细胞密度为1×106个/ml,接种于6孔板培养24小时,半定量逆转录聚合酶联反应（reversedtranscript-polymerase chain reaction,RT-PCR）法检测细胞内趋化因子mRNA的表达情况。5.采用SPSS 13.0统计软件,所有数据用均数±标准差（（?）±s）表示,经正态性检验和方差齐性检验,方差齐后进行多因素方差分析,并用LSD-t检验对各组均数之间进行两两比较。复制衰老和细胞内趋化因子的表达之间的关系用Pearson相关关系分析,P＜0.05具有统计学意义。结果:1.体外培养的人原代RPE细胞生长良好,附壁后呈圆形,或扁平多角形,富含色素颗粒,传代稳定,传代后色素颗粒明显减少,免疫组化鉴定抗角蛋白抗原阳性。2.随着蓝光光照度的增加,复制衰老阳性细胞数目逐渐增多,不同光照度之间差异有统计学意义（P=0.0031）;在不同的光照度之间,LSD-t两两比较发现,除中光照与高光照组相比,差异没有统计学意义（P=0.094）外,其余每两组之间的差异均具有统计学意义（P＜0.05）;随着传代次数增加,复制衰老阳性细胞数目逐渐增多,不同代次数之间差异具有统计学意义（P=0.0057）;在不同的传代次数之间,LSD-t两两比较发现,除第4代和第5代之间差异没有统计学意义（p=0.059）外,其余每两组之间的差异均具有统计学意义（P＜0.05）。3.通过半定量RT-PCR法检测,随光照度增加,细胞内趋化因子的mRNA表达增加,不同光照度之间差异有统计学意义（P＜0.01）;在不同的光照度之间,LSD-t两两比较发现,除中光照与高光照组相比差别没有统计学意义（P＞0.05）外,其余每两组之间的差异均具有统计学意义（P＜0.05）。细胞内趋化因子的mRNA表达随传代次数增加而表达增加,不同传代次数之间差异具有统计学意义（P＜0.01）;在不同的传代次数之间,LSD-t两两比较发现,除第4代和第5代之间差异没有统计学意义（P＞0.05）外,其余每两组之间的差异均具有统计学意义（P＜0.05）。4.随着人RPE细胞复制衰老的增加,细胞内趋化因子的表达增加,复制衰老和趋化因子白介素8（interleukin-8,IL-8）之间相关具有统计学意义（r=0.736,P=0.0087）;复制衰老和趋化因子单核细胞趋化蛋白1（monocytechemoattractant protein-1,MCP-1）之间相关具有统计学意义（r=0.682,P=0.015）。结论:1.应用胰蛋白酶消化法,成功的培养了人原代RPE细胞,经免疫组化鉴定,可以作为人RPE细胞来源,细胞生长良好,可以正常传代,而且培养的人原代RPE细胞形态和数量基本可以满足实验的需要。2.本研究应用SA-β-Gal染色的方法,证实了蓝光可以诱导体外培养人RPE细胞复制衰老,并且光照度和传代次数可促进细胞复制衰老。3.本研究用半定量RT-PCR法检测了人RPE细胞内趋化因子mRNA的表达情况,证实了蓝光可以促进人RPE细胞内趋化因子的表达,并且光照度和传代次数增加,可以促进细胞内趋化因子的表达。4.本研究证实了人RPE细胞复制衰老的增加,可以促进细胞内趋化因子的表达,因此,当人RPE细胞发生复制衰老时,细胞内趋化因子的mRNA表达上调。5.本研究率先将蓝光、RPE细胞复制衰老、和趋化因子结合起来,对于蓝光诱导人RPE细胞复制衰老的机制研究提供理论支持,对于蓝光诱导细胞内趋化因子的表达提供理论支持,对于人RPE复制衰老细胞内趋化因子mRNA上调提供理论支持,对于阐释蓝光光照、RPE细胞复制衰老和炎症在AMD的发病机制中的作用提供理论依据。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 蓝光对人RPE复制衰老细胞内趋化因子mRNA表达的影响
• 1.1 对象和方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述
• 蓝光对视网膜色素上皮细胞的损伤机制
• 综述参考文献
• 致谢