重楼皂甙Ⅱ对系膜细胞凋亡及细胞外基质的影响

论文摘要

背景肾小球系膜细胞（mesangial cell-MC）增生和系膜基质增多是人类主要肾脏疾病如IgA肾病、膜增殖性肾炎、狼疮性肾炎、局灶节段性肾小球硬化、糖尿病肾小球硬化的主要病变。MC分泌细胞因子及细胞外基质,参与肾小球炎症发展过程,促进肾小球硬化。因此抑制炎症状态下MC的增殖与分泌,在增殖性肾小球疾病治疗中有重要意义。重楼主要活性成分重楼总皂甙具有抗炎、免疫调节、抗肿瘤、镇静镇痛、止血、抑菌等作用。研究发现重楼皂苷Ⅱ是作用较强的免疫调节剂。目前对于重楼皂甙Ⅱ的研究主要集中在抑制肿瘤细胞增殖诱导其凋亡及免疫调节等方面,而对肾小球系膜细胞增殖、凋亡及细胞外基质尚缺乏研究。目的研究重楼皂甙Ⅱ对异常增殖的MC及MC分泌细胞外基质（ECM）的影响及抑制MC异常增殖的作用机制。方法常规培养MC细胞,根据乳酸脱氢酶（LDH）及细胞毒性测定结果确定重楼皂甙Ⅱ作用最佳浓度。细胞分组：（1）空白组：含10%胎牛血清的1640培养基；（2）脂多糖（LPS）组：LPS10ug/ml+含10%胎牛血清的1640培养基；（3）PPⅡ30ug/ml组：LPS10ug/ml+PPⅡ30ug/ml+10%胎牛血清的1640培养基；（4）PPⅡ40ug/ml组：LPS10ug/ml+PPⅡ40ug/ml+10%胎牛血清的1640培养基；（5） PPⅡ50ug/ml组：LPS10ug/ml+PPⅡ50ug/ml+10%胎牛血清的1640培养基；（6）雷公藤T4组：LPS10ug/ml+雷公藤T448ug/ml+10%胎牛血清的1640培养基。CCK-8法、Hoechst染色法及流式细胞技术检测PPⅡ对LPS刺激的细胞凋亡的影响。收集培养24小时后细胞总RNA及总蛋白,用Real-time PCR检测细胞Bax、Bcl-2、FN和Col-ⅣmRNA水平的表达,采用Western blot检测Bax、Bcl-2、FN和Col-Ⅳ蛋白水平的表达。结果（1）乳酸脱氢酶（LDH）及细胞毒性测定实验显示：不同浓度PPⅡ作用24小时后,PPⅡ60ug/ml浓度组LDH较其余各组明显升高（P<0.01）,有细胞毒性。遂本实验PPⅡ浓度取30ug/ml,40ug/ml, 50ug/ml。（2）LPS组各个时间点MC细胞的吸光度值高于普通培基组（P<0.01）,提示LPS对MC有诱导增殖作用。不同浓度PPⅡ作用于LPS刺激的MC细胞,随着PPⅡ浓度增大,吸光度值渐趋下降。PPⅡ30ug/ml 12小时干预组与LPS组比较,吸光度值降低,但无明显差异（P>0.05）。PPⅡ30ug/ml组24及36小时与LPS组相比,吸光度值降低,差异性显著（P<0.01）,提示PPⅡ对LPS刺激MC凋亡诱导有一定时效性；PPⅡ40ug/ml及PPⅡ50ug/ml组各个时间点LPS组比较,吸光度值降低,有明显差异（P<0.01）,且同一时间点PPⅡ不同浓度间比较,差异性显著,提示PPⅡ对LPS刺激下MC凋亡诱导有一定量效性；雷公藤T4组与PPⅡ40ug/ml组比较,无明显差异（P>0.05）,与PPⅡ50ug/ml组比较,吸光度值增高,差异性显著（P<0.01）,提示雷公藤T4对LPS刺激下MC凋亡诱导作用,不及高浓度PPⅡ。（3） Hoechst染核示：空白组MC包膜完整,包核染色较深且均一。LPS组较空白组比较,细胞数增加,余无明显变化,PPⅡ组MC包膜有不同程度的皱缩,染色质聚集,荧光增强,伴不同形状的碎裂,形成凋亡小体。（4）流式细胞技术示：空白组MC凋亡率为4.23%±0.24%,LPS组MC凋亡率降低2.23%±0.23%,PPⅡ各组凋亡率明显升高。PPⅡ各组及雷公藤T4组较LPS组相比,均有显著性差异（P<0.01）,表明PPⅡ及雷公藤T4均能诱导LPS刺激下的MC细胞的凋亡；而且PPⅡ各组之间两两比较,均有显著性差异（P<0.01）,提示PPⅡ诱导LPS刺激下的MC细胞的凋亡有一定的量效关系；雷公藤T4组与PPⅡ40ug/ml组相比,无明显差异性（P>0.05）,与PPⅡ50ug/ml组相比,明显差异性（P<0.01）,提示雷公藤T4诱导LPS刺激下的MC细胞的凋亡作用弱于高浓度PPⅡ。（5） Real-time PCR及Western blot示：与空白组比较,LPS组Bax（mRNA）和蛋白、Bcl-2 mRNA和蛋白表达量均上调,PPⅡ各组及雷公藤T4与LPS组比较,Bcl-2 mRNA和蛋白表达量均下调,且PPⅡ各组间两两比较,均有显著性差异（P<0.05）,PPⅡ各组及雷公藤T4与LPS组比较,Bax mRNA和蛋白表达量均上调,且PPⅡ各组间两两比较,均有显著性差异（P<0.05）,提示PPⅡ通过上调Bax/Bcl-2水平抑制LPS诱导下MC增殖,且呈一定量效-时效关系。（6）Real-time PCR及Western blot示：与空白组相比,LPS组FN mRNA和蛋白、ColⅣmRNA和蛋白与分泌明显增加,提示LPS有诱导MC分泌ECM作用。PPⅡ各组及雷公藤T4与LPS组比较,均有显著性差异（P<0.05）。PPⅡ各组间两两比较,均有显著性差异（P<0.05）,提示PPⅡ抑制LPS刺激下MC分泌ECM存在一定量效关系,雷公藤T4与PPⅡ40ug/ml组比较无显著性差异（P>0.05）,与PPⅡ50ug/ml有显著性差异（P<0.01）,提示雷公藤T4抑制LPS刺激下MC分泌ECM不及高浓度PPⅡ结论1、PPⅡ通过上调bax/bcl-2水平诱导MC凋亡2、PPⅡ能抑制MC异常增殖,减少ECM堆积,呈一定效量-时效关系。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 系膜细胞
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 主要试剂的配制及储存
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 实验技术路线图
• 2.2.2 系膜细胞的培养
• 2.2.3 乳酸脱氢酶（LDH）及细胞毒性测定
• 2.2.4 CCK-8检测PPⅡ对LPS刺激下MC细胞凋亡的影响
• 2.2.5 Hoechst染色检测PPⅡ对LPS刺激下MC细胞凋亡的影响
• 2.2.6 流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染检测PPⅡ对LPS刺激下MC细胞凋亡的影响
• 2.2.7 Western Blot检测PPⅡ对LPS刺激下MC细胞中Bax、Bcl-2、FN、Col-Ⅳ蛋白表达的影响
• 2.2.8 Realtime-PCR检测检测PPⅡ对LPS刺激下MC细胞中Bax、Bcl-2FN、Col-Ⅳ蛋白表达的影响
• 2.3 统计学处理
• 第三章 实验结果
• 3.1 乳酸脱氢酶（LDH）及细胞毒性测定
• 3.2 CCK-8检测PPⅡ对LPS刺激下MC细胞凋亡的影响
• 3.3 Hoechst染色检测PPⅡ对LPS刺激下MC细胞凋亡的影响
• 3.4 流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染检测PPⅡ对LPS刺激下MC细胞凋亡的影响
• 3.5 PPⅡ对LPS刺激后MC细胞Bax mRNA和蛋白表达的影响
• 3.6 PPⅡ对LPS刺激后MC细胞Bcl-2mRNA和蛋白表达的影响
• 3.7 PPⅡ对LPS刺激后MC细胞FN mRNA和蛋白表达的影响
• 3.8 PPⅡ对LPS刺激后MC细胞Col-Ⅳ mRNA和蛋白表达的影响
• 第四章 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间主要的研究成果