复合L-色氨酸发酵微生态制剂及其应用研究

论文摘要

本研究进行枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌单一和复合液体发酵，获得含有L-色氨酸的发酵液，然后将发酵液与豆腐渣进行二次固体复合发酵，经干燥粉碎制成粉末状微生态制剂，以一定比例添加于禽用基础日粮中进行饲喂，研究其应用效果。本研究所得结果如下：1、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JMU315-A优化后的单独发酵工艺为：液体发酵种子液的最佳活化时间为18h，活化温度为37℃，种子液初始pH为7.50，装液量为30mL/300mL；液体发酵温度37℃，初始pH为7.50，碳源为0.5%的蔗糖，氮源为4%的豆渣，NaCl添加量为0.6%，发酵48h；固体发酵含水量为50%，发酵48h。发酵后的豆腐渣具有一定的微生态活性，蛋白酶活性为3740.91U/g*（每克固体培养基）、多肽含量为11.3mg/g*、枯草芽孢杆菌菌数为1.03*109pfu/g*。2、谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）JMU315-B优化后的单独发酵工艺为：种子活化阶段，最佳活化时间为22h，活化温度为32℃，种子液初始pH为6.8；发酵阶段，最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为玉米浆与硫酸铵以3:2混合的混合氮源，最佳接种量为8%，最佳发酵温度为32℃，发酵液初始pH为6.8，最佳发酵时间96h；葡萄糖最佳初始浓度为10g/100mL，硫酸铵初始浓度为1g/100mL，分5次每隔12h流加20%的硫酸铵及浓度为40%的葡萄糖溶液的混合液（V:V=1:1）至葡萄糖终浓度为14g/100mL，硫酸铵终浓度为4%。此最优条件下，L-色氨酸在发酵96h的浓度为403mg/L，比未流加组提高了约50%，比优化前合成量提高了约8.6倍，优化效果显著。3、优化了产蛋白酶的枯草芽孢杆菌JMU315-A和产L-色氨酸的谷氨酸棒状杆菌JMU315-B进行复合发酵的工艺。通过复合液体发酵和复合固体二次发酵，发现复合发酵能促进合成L-色氨酸。复合液体发酵优化工艺：确定菌株JMU315-A先于菌株JMU315-B24h转接入复合发酵培养基；枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒状杆菌的接种比例为4:1；总接种量为9%；复合发酵葡萄糖最佳浓度为14%；豆腐渣最佳含量为4%；复合液体发酵温度调节方式为发酵前24h37℃，24-48h35℃，48h后32℃；硫酸铵初始浓度为1%，分五次间隔12h流加至终浓度为4%。通过对三个主要因素，豆腐渣浓度、硫酸铵流加次数和葡萄糖浓度三因素进行正交实验验证优化的发酵条件，确定三个因素对L-色氨酸合成的影响由大小分别为豆腐渣浓度、葡萄糖浓度、硫酸铵流加次数。综合以上优化的发酵条件，复合发酵108h时，L-色氨酸含量达到最大（961mg/L），比谷氨酸棒状杆菌单独发酵至L-色氨酸最高累计量时提高约1.50倍。固体发酵优化工艺：90%湿度、37℃、含水量75%条件下发酵48h后多肽和L-色氨酸分别为12.7mg/g*（每克固体培养基）和3.23mg/g*。烘干阶段优化工艺：固体培养基平铺于培养皿，厚度为0.40cm，80℃烘干13h后L-色氨酸含量为10.8mg/g**（g**指取样时每克烘干物质）。4、通过应用实验，既验证了复合L-色氨酸微生态制剂具有降低实验鸡料肉比、提高非特异性免疫、促进肠道益生菌生长等生理作用，也为该制剂日后生产实践中粗蛋白、纤维素等相关比例的调整提供了依据，即粗蛋白浓度过高、纤维素浓度过低均会提高料肉比，从而降低经济效益。通过综合比较，以添加5%制剂的混合日粮为最佳配方，该添加比例能平衡日粮中的氨基酸、显著降低实验鸡的料肉比（其料肉比在试验终止时比对照组降低19.4%）、提高非特异性免疫活性（溶菌酶和免疫器官指数分别比对照组提高4.04%和0.641%）、有效促进其肠道益生菌的生长（肠道乳酸杆菌数和大肠杆菌数分别为对照组的263%和22.3%），满足了微生态制剂对于提高生长性能（肠道纤维素酶和蛋白酶分别比对照组提高169%和60.4%）、提高经济效益的基本要求。今后可以其中L-色氨酸含量、多肽含量、枯草芽孢杆菌数为基准，调整混合日粮中的粗蛋白、纤维素比例，以实现更高的经济效益。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 微生态制剂研究进展
• 1.1.1 微生态制剂分类
• 1.1.2 微生态制剂作用机理
• 1.1.3 微生态制剂常用菌种
• 1.1.4 饲用枯草芽孢杆菌种类及作用机理
• 1.1.5 微生态制剂制备常用方法
• 1.1.6 动物微生态制剂的生态学效应研究
• 1.1.7 微生态制剂应用现状
• 1.1.8 微生态制剂应用中存在的问题
• 1.1.9 微生态制剂应用前景
• 1.2 L-色氨酸研究进展
• 1.2.1 L-色氨酸性质及生理作用
• 1.2.2 L-色氨酸生产现状
• 1.3 本课题研究意义
• 1.4 本课题研究内容
• 1.4.1 本课题研究内容
• 1.4.2 技术路线图
• 1.5 创新点
• 第2章 枯草芽孢杆菌液发酵豆腐渣条件优化
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 供试菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 实验常用试剂
• 2.1.4 仪器与设备
• 2.1.5 常用试剂配制
• 2.1.6 实验方法
• 2.1.7 优化方案
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 活化时间的确定
• 2.2.2 活化温度的确定
• 2.2.3 种子液初始 pH 的确定
• 2.2.4 种子液装液量的确定
• 2.2.5 最佳碳氮源的选择
• 2.2.6 碳氮源最佳浓度确定
• 2.2.7 液体发酵培养基初始 pH 确定
• 2.2.8 最佳接种量确定
• 2.2.9 最佳发酵温度
• 2.2.10 无机盐对液体发酵的影响
• 2.2.11 正交验证
• 2.2.12 液体发酵时间确定
• 2.2.13 固体发酵含水量选择
• 2.2.14 固体发酵初始 pH 确定
• 2.2.15 固体发酵时间确定
• 2.3 小结
• 第3章 谷氨酸棒状杆菌发酵条件优化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 供试菌种
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 实验常用试剂
• 3.1.4 仪器与设备
• 3.1.5 常用试剂配制
• 3.1.6 实验方法
• 3.1.7 优化方案
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 确定最佳活化时间
• 3.2.2 确定最佳活化温度
• 3.2.3 种子液初始 pH 的选择
• 3.2.4 液体发酵培养基最佳碳源及其浓度优化
• 3.2.5 液体发酵培养基最佳碳源浓度优化
• 3.2.6 液体发酵培养基最佳氮源浓度优化
• 3.2.7 确定最佳发酵初始 pH
• 3.2.8 确定最佳接种量
• 3.2.9 最佳发酵温度的确定
• 3.2.10 碳氮源流加优化
• 3.3 小结
• 第4章 复合发酵微生态制剂复合生产工艺优化
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验菌种
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 实验常用试剂
• 4.1.4 仪器与设备
• 4.1.5 常用试剂配制
• 4.1.6 实验方法
• 4.1.7 优化方案
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 复合液体发酵两株菌添加方式优化
• 4.2.2 复合液体发酵两株菌添加比例优化
• 4.2.3 复合液体发酵接种量优化
• 4.2.4 复合液体发酵葡萄糖浓度优化
• 4.2.5 复合液体发酵豆腐渣浓度优化
• 4.2.6 复合液体发酵培养温度优化
• 4.2.7 复合液体发酵葡萄糖流加方式优化
• 4.2.8 复合液体发酵硫酸铵流加方式优化
• 4.2.9 复合液体发酵正交优化
• 4.2.10 复合液体发酵时间优化
• 4.2.11 固体发酵含水量优化
• 4.2.12 固体发酵时间优化
• 4.2.13 烘干温度优化
• 4.2.14 烘干时间优化
• 4.3 小结
• 第5章 复合 L-色氨酸发酵微生态制剂效能评价
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 日增重
• 5.2.2 消化酶
• 5.2.3 非特异性免疫——溶菌酶、免疫器官指数
• 5.2.4 肠道及粪便中的大肠杆菌和乳酸杆菌
• 5.3 小结
• 第6章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 在校期间发表的学术论文