论文摘要
为了建立乳腺生物反应器,获得蚓激酶在牛乳腺中表达,本研究采用分子生物学与转基因技术,构建了蚓激酶乳腺特异性表达载体及逆转录病毒载体,在牛乳腺组织中进行了蚓激酶的表达研究,然后利用逆转录病毒转染家兔精原干细胞,旨在建立蚓激酶转基因家兔,为最终获得其转基因奶牛乳腺生物反应器奠定基础。首先构建了以山羊β-酪蛋白基因（β-casein）5′区调控序列（BCP）为启动子、蚓激酶基因（lumbrokinase,LK）为目的基因的乳腺特异性表达载体pBLK,然后将BCP与LK表达盒克隆到骨架为Moloney小鼠白血病病毒（MoMLV）、含有标记基因NeoR的逆转录病毒载体pLNCL中,构建了蚓激酶重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LK。将上述两个载体转染泌乳期奶牛乳腺小叶,蚓激酶基因在乳腺组织实现了有效表达;进而在脂质体介导下将pLN-BCP-LK质粒转染包装细胞PA317,获得可持续产生病毒颗粒的细胞克隆;利用重组逆转录病毒转染妊娠期奶牛乳腺,在泌乳期采集乳汁检测蚓激酶表达,结果显示,蚓激酶在乳腺中实现了稳定表达。在上述试验基础上,将重组逆转录病毒制成转染液,单侧注射3月龄雄性家兔睾丸曲细精管。待其发育成熟后,利用该家兔进行繁殖,对获得的子代兔进行目的基因的PCR及Southern blotting检测,结果显示:PCR及Southernblotting检测结果一致,本试验获得的转基因家兔阳性率为6.25%。
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