猪骨骼肌发育相关基因的差异表达和多态性研究

论文摘要

本论文第一部分研究工作集中于细胞外基质和粘附分子基因在不同猪种间的差异表达。细胞外基质和粘附分子参与调控了细胞增殖、分化、粘附和迁移,在骨骼肌生长发育过程中发挥着重要作用。本研究利用含有96个细胞外基质和粘附分子（细胞外基质蛋白、细胞粘附因子、蛋白酶和蛋白酶抑制因子）基因的cDNA芯片,筛选了长白猪、通城猪和五指山猪胚胎期第65天（L65、T65和W65）骨骼肌中的差异表达基因,并对其进行聚类分析,同时利用DAVID数据库对其进行生物学功能分析（Gene Ontology和pathway）。此外,我们利用QPCR方法对10个差异表达基因对芯片结果进行验证,同时选择了5个差异表达基因（ITGA7、ITGB3、CAV1、FN1和MMP2）,利用QPCR方法比较分析了其在长白猪和通城猪出生前、后骨骼肌中的表达谱。芯片结果显示,共筛选出35个差异表达基因,其中18个基因位于L65/T65（15个基因在L65中表达上调）,18个基因位于L65/W65（13个基因在L65中表达上调）,20个基因位于T65/W65（14个基因T65中表达下调）;W65与L65和T65间的差异表达基因主要集中于细胞外基质蛋白和细胞粘附因子;促进骨骼肌发育的、上调基因的数量在L65中较多,在T65和W65中的数量较少。聚类分析表明,细胞外基质和粘附分子基因在T65与L65中具有更相似的表达谱,而在W65中的表达谱差异较大。同时GO和pathway富集分析显示,差异表达基因主要涉及到GO中生物学过程分类的细胞粘附、细胞与基质粘附和整合素介导的信号通路;黏着斑、细胞外基质与受体相互作用及肌动蛋白骨架调控等生物学过程和信号通路,提示差异表达基因与猪骨骼肌发育有着密切联系。QPCR验证结果表明:芯片结果是准确可靠的,细胞外基质和粘附分子基因在不同品种间的确存在差异表达。基因表达谱分析结果显示:ITGA7、ITGB3、CAV1、FN1和MMP2基因在长白猪和通城猪胚胎期骨骼肌中的表达水平均显著高于出生后阶段;5个基因在两个品种间的表达谱差异主要集中于胚胎期;与通城猪相比,5个基因的高表达水平在长白猪胚胎期持续更长的时间。上述结果表明:细胞外基质和粘附分子基因在三个猪种间的表达具有差异性,主要参与不同品种胚胎期骨骼肌发育的调控。五指山小型猪骨骼肌具有较为特殊的、与细胞外基质和粘附分子相关的分子事件。本部分研究进一步阐述了与不同类型猪种表型差异相关的骨骼肌发育异步性的分子机制,为猪产肉性状候选基因的筛选和鉴定提供了一定的信息资源。本论文第二部分研究工作集中于猪MSTN基因多态性研究。肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）是肌肉生长生长发育过程中的一个关键负性调控因子,其碱基突变能够抑制MSTN功能的发挥,进而导致了动物个体表现出双肌臀表型。本研究以猪MSTN基因为候选基因,通过对6个猪种,共76个个体（长白猪、大白猪、杜洛克猪、莱芜猪、通城猪和五指山小型猪）的全长MSTN基因进行测序和比较分析,共筛选出16个多态位点, 4个位于启动子区域,5个位于第1内含子,7个位于第2内含子,其中P4（879 bp）和P5（1735 bp）位点仅出现野生基因型和杂合突变基因型。接下来,我们选择P1、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9和P10位点,利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术,确定9个多态位点在372头猪中的基因型分布情况。分型结果显示,P1、P3、P4和P5在两个群体中具有多态性,而P6、P7、P8、P9和P10位点不具多态性,其中P4和P5两个位点仅出现野生型和杂合突变型两种基因型,且两个位点的基因型在所分析的群体中呈完全连锁。利用最小二乘法对4个位点的多态性与猪出生重和21日龄断奶重进行关联性分析,结果发现:对于P4和P5位点,具有杂合突变基因型（TA或GA）个体的出生重和21日龄断奶重均显著高于野生基因型（TT或GG）个体（p<0.05）;P4和P5合并基因型效应分析显示,TAGA基因型个体的出生重和21日龄断奶重均显著高于TTGG基因型个体（p<0.05）。利用TFSEARCH工具对突变前后转录因子结合位点的变化进行预测,发现P4位点的突变导致增加了2个CdxA转录因子结合位点。上述结果提示,P4和P5位点的基因型效应与猪出生重和21日龄断奶重性状显著相关,具有作为分子标记辅助猪育种的潜在应用价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 肌肉发育相关基因的鉴定分析
• 第一章 文献综述
• 1.1 细胞外基质
• 1.1.1 糖蛋白类
• 1.1.2 葡萄糖胺聚糖和蛋白胺聚糖
• 1.1.3 胶原蛋白
• 1.2 细胞外基质与肌肉生长发育
• 1.3 不同猪种间的肌肉生长发育
• 1.4 cDNA 微芯片技术
• 1.5 研究目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 cDNA 芯片
• 2.1.3 常规试剂和试剂盒
• 2.1.4 实验试剂及其配制
• 2.1.5 主要仪器及设备
• 2.1.6 分析工具及网站
• 2.2 方法
• 2.2.1 总RNA 提取
• 2.2.2 变性琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.3 cDNA 合成
• 2.2.4 芯片实验
• 2.2.5 QPCR 及数据分析
• 2.2.6 聚类分析
• 2.2.7 差异表达基因的GO 和PATHWAY 分析
• 第三章 结果与分析
• 3.1 RNA 提取
• 3.2 QPCR 实验
• 3.3 芯片杂交
• 3.4 芯片结果
• 3.5 芯片结果验证
• 3.6 聚类分析
• 3.7 差异表达基因的 GO 和 PATHWAY 分析
• 3.8 不同品种间的差异表达基因分析
• 3.9 ECMs 和 CAMs 基因动态表达
• 第四章 讨论
• 4.1 差异表达基因的 GO 和 PATHWAY 分析
• 4.2 三个品种间的差异表达基因
• 4.2.1 差异表达基因的分类
• 4.2.2 差异表达基因的分布
• 4.3 基因表达模式分析
• 第五章 结论
• 第二部分 MSTN 基因多态性分析
• 第一章 文献综述
• 1.1 MSTN 研究进展
• 1.1.1 MSTN 基因结构和功能
• 1.1.2 MSTN 活性调控
• 1.1.3 MSTN 与细胞
• 1.1.4 MSTN 信号途径
• 1.1.5 MSTN 的应用
• 1.2 分子遗传标记
• 1.2.1 限制性片段多态性
• 1.2.2 微卫星标记
• 1.2.3 单核苷酸多态性
• 1.3 SNP 检测方法
• 1.3.1 未知SNP 检测方法
• 1.3.2 已知SNP 检测方法
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 菌株和载体
• 2.1.3 常规试剂和试剂盒
• 2.1.4 实验试剂及配制
• 2.1.5 主要仪器与设备
• 2.1.6 分析工具及网站
• 2.2 方法
• 2.2.1 基因组DNA 提取
• 2.2.2 PCR 反应
• 2.2.3 PCR 产物的回收纯化
• 2.2.4 连接反应
• 2.2.5 转化
• 2.2.6 阳性克隆鉴定
• 2.2.7 测序验证
• 2.2.8 MALDI-TOF-MS 法 SNP 分型
• 2.2.9 数据分析
• 第三章 结果与分析
• 3.1 基因组提取
• 3.2 引物的设计
• 3.3 SNPs 位点筛选
• 3.4 突变前后转录因子结合位点的预测
• 3.5 质谱法 SNP 分型
• 3.6 多态位点的关联性分析
• 3.6.1 生长性状统计
• 3.6.2 等位基因频率和基因型频率
• 3.6.3 多态位点不同基因型与体重的关系分析
• 第四章 讨论
• 4.1 MSTN 基因 SNPs 的筛选
• 4.2 转录因子结合位点的预测
• 4.3 猪 MSTN 基因多态性与体重的关联性分析
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简历