马铃薯叶片GalLDH基因的克隆及在温度胁迫下的表达

论文摘要

抗坏血酸（L-ascorbic acid,AsA）,是植物和大多数动物体内合成的一类含量丰富的己糖内酯化合物,在植物抵抗氧化胁迫中具有重要作用。植物中AsA的重要性不仅在于它在植物抵抗氧化胁迫中具有重要作用,而且近年来的研究发现,AsA对于光合作用和光保护、细胞的生长和分裂以及一些重要次生代谢物和乙烯的合成等诸多方面起着非常重要的生理功能。GalLDH是催化植物体中AsA合成的最后一步关键酶,对植物体中AsA的生物合成具有重要作用。为了弄清马铃薯GalLDH基因转录与GalLDH活性及抗坏血酸含量的关系,本试验在克隆马铃薯叶片GalLDH基因的基础上,研究了GalLDH在马铃薯不同器官和温度胁迫下叶片转录水平的表达与GalLDH活性、抗坏血酸（AsA）和氧化型抗坏血酸（DHA）含量及抗坏血酸库（AsA+DHA）的关系。研究结果如下:1.通过RT-PCR技术克隆到马铃薯叶片GalLDH基因1738bp片段（EF125868）,与其同科番茄、烟草和辣椒GalLDH基因同源性分别高达93.59%、87.21%和83.03%。2. GalLDH基因转录水平的表达以幼叶和功能叶较高,以老叶和茎最低。AsA含量和GalLDH活性与GalLDH基因表达基本一致。3.GalLDH基因的转录明显受光的诱导,早晨6:00最低,到下午18:00时达最高。而GalLDH活性在12:00达最高,说明还有其它因素参与调控了GalLDH的活性。4.光照下短时间（0h-6h）高温胁迫（40℃）与常温（20℃）相比,马铃薯叶片AsA含量明显增加,随后随光照时间延长（6h-12h）又明显下降;转入黑暗之后,AsA含量又略有增加。而马铃薯叶片AsA含量在高温胁迫下的变化与GalLDH基因在转录水平的增加及GalLDH活性的增强相吻合。说明高温胁迫下GalLDH基因在转录水平的增加是马铃薯叶片AsA含量增加的主要原因。5.光照下短时间（0h-6h）低温胁迫（4℃）与常温（20℃）相比,马铃薯叶片AsA含量明显增加,随后随光照时间延长（6h-12h）又明显下降;转入黑暗之后,AsA含量又趋于稳定,但是在低温胁迫期间马铃薯叶片AsA含量始终明显高于常温（20℃）处理。而低温胁迫期间马铃薯叶片GalLDH基因在转录水平和GalLDH活性始终明显低于常温（20℃）处理,说明低温胁迫期间马铃薯叶片AsA含量的增加并非由GalLDH基因转录和GalLDH活性影响所致。6.低温胁迫下马铃薯叶片AsA含量始终明显高于常温（20℃）处理的原因与其较低的DHA含量有关。由此推测,低温胁迫下AsA含量的增加主要是通过DHA的还原形成。7. GalLDH基因与含有35S启动子的pBI121载体重组,构建了反义表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,经PCR方法检测,已获转反义基因的烟草植株。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 植物中AsA 合成的研究
• 1.2 植物中AsA 代谢的研究
• 1.3 植物中AsA 的转运
• 1.4 植物AsA合成代谢关键酶研究进展
• 1.4.1 GDP-甘露糖焦磷酸化酶（GMPase）
• 1.4.2 L-半乳糖-1, 4-内酯脱氢酶（GalLDH）
• 1.4.3 脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）
• 1.5 本研究的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 材料处理
• 2.1.3 菌株与质粒
• 2.1.4 酶及生化试剂
• 2.1.5 PCR 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 利用TRIZOL 试剂盒提取RNA
• 2.2.2 反转录cDNA 第一条链的合成
• 2.2.3 目的基因的分离
• 2.2.3.1 中间片段的获得
• 2.2.3.1.1 RT-PCR 扩增目的片段
• 2.2.3.1.2 连接反应
• 2.2.3.1.3 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
• 2.2.3.1.4 碱法小量提取质粒DNA
• 2.2.3.1.5 质粒DNA 的酶切鉴定
• 2.2.3.1.6 序列测定
• 2.2.3.2 目的基因cDNA 3′端片段的分离
• 2.2.4 GalLDH 基因反义表达载体的构建
• 2.2.4.1 表达载体的构建
• 2.2.4.2 回收
• 2.2.5 农杆菌介导转化烟草
• 2.2.5.1 农杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.5.2 冻融法转化农杆菌
• 2.2.5.3 利用农杆菌介导转化烟草
• 2.2.6 转基因烟草植株的PCR 检测
• 2.2.6.1 CTAB 法微量法提取基因组DNA
• 2.2.6.2 转基因植株的PCR 筛选
• 2.2.7 荧光定量PCR（Real-time quantitative RT-PCR）
• 2.2.8 AsA 含量的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 GalLDH 的分离及其特征
• 3.1.1 GalLDH 中间片段的分离
• 3.1.2 GalLDH 基因序列分析
• 3.2 表达载体的构建
• 3.3 基因表达特性分析
• 3.3.1 GalLDH 基因在野生型马铃薯中的表达
• 3.3.2 温度胁迫对光照和黑暗下马铃薯叶片GalLDH 基因的转录水平、GalLDH 活性和抗坏血酸含量的影响
• 3.3.2.1 AsA 含量
• 3.3.2.2 DHA 含量
• 3.3.2.3 AsA+DHA
• 3.3.2.4 GalLDH 活性
• 3.3.2.5 GalLDH 基因转录水平
• 3.4 转反义GalLDH 基因烟草的检测
• 4 讨论
• 4.1 马铃薯不同器官GalLDH 基因表达
• 4.2 光照对 GalLDH 基因表达的影响
• 4.3 温度对GalLDH 基因表达的影响
• 5 结论
• 6 参考文献
• 7 致谢