苏云金芽胞杆菌杀线虫菌株的筛选及其活性因子研究

论文摘要

化学农药对农业有害生物的防治虽然成效显著,但是由于日益恶化的环境问题,微生物农药的使用是大势所趋。苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）制剂是目前应用最为成功的一类微生物杀虫剂,在植物病害防治方面也取得了一定的进展。深入挖掘我国丰富的苏云金芽胞杆菌资源,分离克隆新型高毒力的杀虫蛋白基因,对构建高效广谱工程微生物和培育转基因抗虫植物具有重要的理论意义和应用价值。新秀丽小杆线虫（Caenorhabditis elegans）是蘑菇等真菌上的重要病原线虫,同时也是一种模式生物,能够在室内培养。本试验采用大肠埃希氏菌饲养,获得大量虫源,建立了以C.elegans为生物测定指标筛选高活力Bt菌株的技术路线,成功地筛选到高效活性菌株Bt 010。从Bt 010中克隆表达了两类Bt毒性因子:晶体蛋白和几丁质酶,采用质谱手段证实了几丁质酶的存在。该试验初步揭示了Bt侵染线虫的机制,丰富了Bt侵染线虫过程中的致病毒力因子几丁质酶的性质及其酶基因,为研究Bt侵染线虫的机制提供了有益的佐证。通过生物测定观察线虫对不同研菌株所产生的毒力反应,发现在118株Bt中只有6株对线虫有毒性,作用时间大约在36h左右,6株中Bt010最为理想,其LC50为0.498μg/ml。Bt010伴孢晶体以菱形和方形为主,对其基因组进行PCR扩增,发现该菌株的基因组中存在cry 1Ⅰa,而未见预期含有的cry 5和cry 6等已知杀线虫的cry基因。根据cry 1Ⅰ基因保守序列设计简并引物,利用PCR技术扩增出杀虫晶体蛋白基因片段并在GenBank登录,登录号为EF065179。对该基因克隆表达结合生测发现该基因的表达产物对线虫不产生毒性作用。提取Bt010的总蛋白进行质谱分析,得到相似肽段推测其主要成分为几丁质酶。利用光学显微镜观察,Bt010处理线虫后,能不同程度地降低线虫的活动力,抑制线虫生长,明显破坏线虫体壁的完整性。透射电镜照片清楚表明Bt010能够有效降解体表层,引起线虫体壁结构的剧烈变化。基于以上结果,根据几丁质酶基因保守序列设计引物,利用PCR技术从Bt010中扩增到几丁质酶Chitinase基因,该基因已在GenBank中登录,登录号为EU030625。对该基因进行了克隆表达,生测发现该菌对线虫具有一定程度的毒杀作用。Bt010在杀灭线虫的过程中对线虫DNA不造成损伤,可以作为Bt安全性实验的辅证。除了对模式线虫Celegans有活性外,Bt010菌株对番茄根结线虫（Meloidogynespp.）也有一定的防效,证明该菌株具潜在的应用价值。本研究的特色和创新主要体现在以下三点:一.建立了以C.elegans生测为指标筛选高活力Bt菌株的技术路线;二.采用质谱手段证实了Chitinase在Bt中的存在;三.率先证实了Bt Chitinase对线虫的毒性作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 植物寄生线虫的危害及主要类群
• 2 植物寄生线虫的防治及存在问题
• 3 植物寄生线虫的生物防治研究
• 4 新秀丽小杆线虫的研究概况
• 5 本研究的目的和意义
• 第二章 新秀丽小杆线虫（C.elegans）的饲养和生物测定
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 线虫的扩大培养
• 2.2 生物测定
• 2.3 虫体感染形态观测
• 50'>2.4 不同菌株伴孢晶体毒素对线虫的半致死终浓度LC₅₀
• 3 讨论
• 第三章 Bt 010的最适培养基筛选与基因鉴定
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 培养基筛选
• 2.2 总DNA电泳检测
• 2.3 Bt 010中cry 1Ia鉴定
• 3 讨论
• 第四章 cry 1Ia基因克隆表达和活性测定
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 cry 1Ia基因在E.coli中的表达
• 2.2 表达产物cry 1Ia蛋白的杀线虫活性
• 2.3 油镜观测结果
• 3 讨论
• 第五章 活性蛋白纯化、肽谱分析以及线虫超微结构的观测
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 毒素蛋白的纯化结果
• 2.2 蛋白测定结果
• 2.5 Bt 010总蛋白作用后线虫超微形态的观测
• 3 讨论
• 第六章 几丁质酶基因的克隆、表达和活性测定
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 克隆质粒的单双酶切
• 2.2 测序结果
• 2.3 蛋白质表达SDS-PAGE图谱
• 2.4 生物测定
• 2.5 几丁质活性测定
• 3 讨论
• 第七章 根结线虫的生物测定和安全性检测
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 Bt chitinase对根结线虫的作用
• 2.2 DNA Ladder检测
• 3 讨论
• 参考文献
• 附录1 论文中使用的缩写词及中英文对照
• 附录2 实验中使用的贮存液、缓冲液、培养基配制
• 附录3 分子设计辅助软件和网上资源
• 附录4 实验中常用的核酸、蛋白质换算（参照TaKaRa）
• 附录5 调整硫酸铵溶液饱和度计算表（25℃）
• 附录6 本论文中使用的基因工程菌株、载体特性及克隆、表达载体的酶切图谱
• 附录7 在NCBI上登录的序列以及质谱图
• 附录8 读博期间发表、撰写的学术论文和申请的发明专利
• 致谢