GSK-3β和CT-1在压力超负荷心肌重构过程中的作用及其机制实验研究

论文摘要

背景及目的心肌重构（myocardial remodeling）包括心肌细胞肥大和细胞外基质增生,是各种心血管疾病发生和发展的病理基础。心肌重构虽然在疾病早期对心脏功能有一定代偿意义,但过度肥厚和纤维化的心肌容易导致继发性心肌缺血、舒张功能减退、心律失常等,从而成为导致病变不断加重的诱发因素。心肌肥厚分子机制的本质是肥大刺激因素通过多种细胞内信号途径诱导了细胞核内基因表达的改变,促进心肌细胞肥大。心肌肥厚过程中细胞因子的作用是必不可少的。其中心肌营养素-1（cardiotrophin-1,CT-1）作为生理调节的重要成分,促进心脏正常发育,促使心肌细胞存活,也参与心室肥厚过程。确定CT-1相关的信号转导通路,特别是与AKT的关系对减轻甚至逆转心肌重构是非常有意义的。目前涉及心肌肥厚的研究主要集中在心肌细胞生长和心肌肥厚相关的各种信号转道的正性调控,负性调控的研究则罕有报道。糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β）属于保守丝氨酸/苏氨酸激酶家族,广泛参与各种细胞功能的调节,包括代谢、基因表达和细胞骨架完整性的维持。有研究表明,GSK-3β通过多种途径促进细胞凋亡。作为一种细胞生长、增殖的负性调控因子,对GSK-3β在心肌肥厚过程中作用机制的研究可望为心肌重构的合理预防和逆转提供非常重要的依据。本课题的研究目的就是探索GSK-3β、CT-1和AKT在压力超负荷性心肌肥厚发生中的变化,揭示GSK-3β、CT-1和AKT在压力超负荷性心肌肥厚信号转导途径中的作用及发生机制。方法课题分为2部分,包括动物实验和细胞培养实验。1、诱导大鼠压力负荷性心肌肥厚,探讨心肌肥厚过程中GSK-3β、AKT、CT-1的表达变化及与心肌组织细胞凋亡、增殖改变之间的关系。采用成年Wistar大鼠54只,随机分为正常组6只,假手术组24只和实验组24只,假手术组和实验组动物观察时相点为术后6h、1d、1w和4w。腹主动脉缩窄术建立压力负荷性大鼠心肌肥厚模型。主要检测指标有:（1）生物信号记录仪系统记录大鼠左室收缩压（SBP）、舒张压（DBP）和平均动脉压（MABP）。（2）检测左心室质量指数。（3）生化法检测心肌羟脯氨酸含量。（4）免疫印迹法检测心肌组织CT-1、AKT、p-AKT、GSK-3β、p-GSK-3β和caspase-3含量。（5）免疫组织化学染色法检测CT-1、AKT、p-AKT、GSK-3β、p-GSK-3β和caspase-3表达变化。（6）TUNEL法检测心肌组织细胞凋亡。（7）流式细胞仪检测心肌组织细胞增殖状况。2、建立体外心肌细胞肥大模型,阐明GSK-3β活性增强及抑制对肥大心肌细胞的作用。心肌细胞肥大采用药物诱导法:向培养基中加入0.1μmol/L AngⅡ+1μmol/LNE。分为对照组、AKT抑制剂SH-6组（AKT inhibitor group,AI组;增强GSK-3β的活性）和GSK-3β抑制组（GSK-3βinhibitor group,GⅠ组;抑制GSK-3β的活性）,对照组不施加处理因素,AI组加入AKT活性抑制剂SH-6(终浓度10-3mg/ml),GⅠ组在AI组的基础上加入GSK-3β活性抑制剂3-（N-[Dimethylamino]propyl-3-indolyl）-4-（3-indolyl）maleimide(终浓度10-3mg/ml)。观察时相点为加药后6h,24h和48h。主要检测指标有:（1）细胞表面积测定,在400倍倒置显微镜下观察,随机选择5个细胞进行测量,单位用μm2表示。（2）心肌细胞蛋白含量的测定,Lowry法测定蛋白质含量。（3）心肌细胞蛋白质合成速率测定,用[3H]-Leu掺入量来反映心肌细胞蛋白质合成速率。（4）心肌细胞凋亡数量的测定,应用TUNEL法进行检测,计算高倍视野下的凋亡细胞数。结果大鼠压力超负荷性心肌肥厚在体实验:（1）实验组术后6h SBP、DBP和MABP即开始显著增加,此后呈进行性增加趋势,术后4w SBP高达（201.5±22.1）mmHg,DBP（170.7±12.4）mmHg,MABP（185.5±15.0mmHg）。假手术组无显著变化。（2）正常组LVMI为（2.01±0.16mg/g）,实验组术后1w和4w LVMI显著增加,术后4w高达（2.41±0.12mg/g）,假手术组术后LVMI无显著变化。（3）正常组心肌羟脯氨酸含量为（3.81±0.14）mg/g,实验组术后1w和4w心肌羟脯氨酸含量显著升高。（4）免疫印迹法检测实验组大鼠CT-1、p-AKT、p-GSK-3β含量显著上升,AKT和GSK-3β含量无显著变化,caspase-3蛋白含量显著降低。（5）TUNEL检测发现实验组术后1w和4w凋亡细胞数量及凋亡率较假手术组显著减少。（6）流式细胞仪检测心肌组织增殖指数术后明显升高。体外心肌细胞肥大模型实验结果:（1）成功培养心肌细胞,横纹肌肌动蛋白抗体鉴定结果,95%的细胞为阳性。（2）对照组心肌细胞表面积未见明显增加或减少,AI组心肌细胞表面积显著减少,GI组心肌细胞表面积较AI组显著升高,但低于对照组水平。（3）AI组心肌细胞蛋白含量显著减少,GI组心肌细胞蛋白含量较AI组显著上升,低于对照组水平。（4）AI组心肌细胞蛋白合成速率显著减少,GI组较试验组显著上升,低于对照组水平。（5）AI组凋亡细胞显著增加,GI组凋亡细胞较AI组减少,高于对照组。结论1、腹主动脉缩窄手术可诱导大鼠发生压力超负荷性心肌肥厚。2、压力超负荷性心肌肥厚模型中心肌CT-1、p-AKT、p-GSK-3β含量显著上升,GSK-3β活性及Caspase-3表达显著下降。3、压力超负荷性心肌肥厚发生过程中心肌细胞凋亡率显著减少。4、CT-1及GSK-3β活性改变参与了压力超负荷性心肌重构过程。5、AKT活性抑制剂可降低体外培养心肌肥厚的相关指标。6、GSK-3β抑制剂不能完全逆转AKT抑制剂对肥大心肌的作用,即AKT活性抑制剂对心肌肥厚的作用不完全通过GSK-3β途径。7、GSK-3β抑制剂可降低心肌细胞凋亡数。

论文目录

• 英文缩写一览表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 论文正文 GSK-3β和CT-1在压力超负荷心肌重构过程中的作用及其机制实验研究
• 前言
• 第一部分 GSK-3p和CT-1在大鼠压力负荷性心肌肥大发生中的变化及信号通路研究
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分 AKT及GSK-3β活性抑制剂对体外肥大心肌细胞的影响
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 全文总结
• 致谢
• 参考文献
• 文献综述一 心肌营养素-1的心血管作用及其信号通路的研究进展
• 参考文献
• 文献综述二 心肌肥大信号转导通路的研究进展
• 参考文献
• 在读期间发表的文章及获得的医疗成果奖和基金