论文摘要
ΔFosB是AP-1（activator protein-1,激活蛋白1）家族中FosB（Finkel-Biskis-Jinkins murine osteosarcoma B,小鼠骨肉瘤基因B）基因的一个自然截短型,缺少FosB C-末端101个富含脯氨酸区域。ΔFosB基因在乳腺、成骨细胞和脑中都有表达,在成骨细胞和脂肪细胞的形成和分化中有重要作用。过表达ΔFosB的转基因小鼠,通过增加骨形成使得骨量增加,同时脂肪含量减少,能够下调脂肪细胞分化早期标志基因的表达。本实验室在山羊的乳腺组织中克隆出ΔFosB基因,山羊的ΔFosB基因由723个碱基组成,编码240个氨基酸。推测山羊ΔFosB可能在调节乳腺钙、脂代谢方面起重要作用,因此本研究拟包装出超表达ΔFosB基因的重组腺病毒。利用课题组已经制备完成的干扰表达ΔFosB基因的重组腺病毒,研究在山羊原代乳腺上皮细胞中超表达和干扰表达ΔFosB基因后,几个钙、脂代谢相关基因的mRNA表达变化,为进一步研究ΔFosB基因在乳腺中调节钙、脂代谢的分子作用机制积累资料。将实验室已经构建好的ΔFosB重组腺病毒载体pAdTrack-CMV-HA-ΔFosB,经PacⅠ线性化后用Lipofectamine 2000转染HEK-293细胞,包装并扩增出ΔFosB重组腺病毒Ad-HA-ΔFosB。经滴度测定后,用最佳MOI值感染山羊原代乳腺上皮细胞,分别于感染后24 h、48 h、72 h收集细胞,用实时荧光定量PCR和Western Blot检测Ad-HA-ΔFosB的超表达效率。将ΔFosB重组腺病毒Ad-HA-ΔFosB和干扰重组腺病毒Ad-ΔFosB-572感染原代乳腺上皮细胞,实时荧光定量PCR检测几个钙、脂代谢相关基因mRNA的相对表达变化。获得主要结果如下:⑴将pAdTrack-CMV-HA-ΔFosB质粒线性化后转染HEK-293细胞,包装并扩增出高滴度的ΔFosB重组腺病毒Ad-HA-ΔFosB,其滴度为4×108U/mL.。⑵用Ad-HA-ΔFosB感染山羊原代乳腺上皮细胞,确定了最佳MOI=200。实时荧光定量PCR检测表明Ad-HA-ΔFosB感染山羊原代乳腺上皮细胞24 h、48 h、72 h后,表达量分别增加了9.40倍、20.18倍和52.49倍（P<0.05）,相应的Western Blot检测结果也表明乳腺上皮细胞中高表达ΔFosB。⑶将Ad-HA-ΔFosB感染乳腺上皮细胞24 h、48 h、72 h后,与钙代谢相关的Runx2基因的mRNA表达量分别提高了1.50倍、3.25倍和7.14倍（P<0.05）。Smad4基因的mRNA的表达量分别提高了1.32倍、1.96倍和3.03倍（P<0.05）。S100 A4基因的mRNA的表达量分别提高了6.54倍、10.80倍和12.95倍（P<0.05）。S100 A13基因的mRNA表达量分别提高了1.96倍、3.23倍和5.00倍（P<0.05）。低表达ΔFosB基因72 h以后,Runx2、Smad4、S100A4和S100A13基因的mRNA表达量分别下降了77%、70%、50%和46%（P<0.05）。⑷将Ad-HA-ΔFosB感染乳腺上皮细胞24 h、48 h、72 h以后,PPARγmRNA的表达量分别增加了9.69倍、23.38倍和35.77倍（P<0.05）。SCD mRNA基因表达量分别增加了5.45倍、9.56倍和3.79倍（P<0.05）,在48 h表达量最高,72 h表达量有所下降。FAS mRNA的表达量没有改变（P>0.05）。