论文摘要
恶性肿瘤严重威胁人类健康，药物治疗是治疗恶性肿瘤的三种基本疗法之一。然而目前临床应用的抗肿瘤药物多具有无组织选择性、较高毒副作用、不稳定性以及半衰期短等缺点，所以前体药物研究受到越来越多的关注。前药是指在体外仅有很小或没有药理活性，在体内酶或非酶作用，经生物转化成代谢产物原药后才具有药理活性的药物。它保持或增强原药的药效，同时又克服了原药的缺点，主要为了改善药物在体内的药物动力学过程，提高对靶部位的作用选择性，降低毒副作用，改善药物的稳定性等。托氟啶（N3-O-toluyl-Fluorouracil，TFu）即3-邻甲苯甲酰基-氟尿嘧啶，是新一代5-氟尿嘧啶（5-Fu）前体药物。前期研究工作表明，TFu具有明确的抗癌活性，体内代谢稳定性好，可选择性地在肿瘤组织内转化为5-Fu而发挥药效。但是该药水溶性较差，不适合静脉注射给药，口服生物利用度也较低，限制了其临床应用。本课题旨在提高TFu的水溶性，制备可方便临床应用的口服及静注TFu新制剂；探索一种生物利用度较高、药物毒性低、稳定性好的给药系统。脂质体是最重要的、最广泛使用的纳米给药系统之一，具有无毒，无免疫原性，组织相容性，能够降低药物的毒性，增强药理作用等。目前，在各种纳米载体中，只有脂质体已应用于临床，其他的纳米系统仍处于临床前研究阶段。课题以大豆卵磷脂和胆固醇为主要膜材，以TFu为模型药物，采用现代靶向制剂技术，制备了TFu脂质体，对TFu注射和口服脂质体给药系统进行临床前研究，研究不同粒径TFu脂质体经不同给药途径后在体内的药物动力学行为和分布特征，并探讨脂质体小鼠口服的吸收机理，为脂质体制剂的开发应用提供了试验基础和理论依据。课题主要研究方法和结果如下：1．托氟啶脂质体药物含量及包封率测定方法的建立采用鱼精蛋白凝聚法将载药脂质体与游离药物分离，建立了HPLC法测定脂质体中TFu的含量及包封率。2．托氟啶脂质体的制备工艺和处方研究以TFu脂质体包封率为主要考察指标，单因素考察有机相种类、药脂比、磷脂和胆固醇比、有机相／水相比例、水浴温度等影响因素，在此基础上，采用均匀设计法对TFu脂质体处方进行优化，选用药脂比、磷脂和胆固醇比、有机相／水相比例为考察因素，以包封率等为指标进行评价，得到TFu脂质体的优化处方。3．托氟啶脂质体的理化性质、体外释药动力学和稳定性研究以及冻干脂质体的制备通过高压匀质乳匀技术控制脂质体粒径，不同乳匀压力下（10bar、80bar、400bar和600bar）脂质体的平均粒径分别为530nm、400nm、320nm和180nm，Zeta电位分别为-6.76 mV、-6.64 mV、-6.44 mV和-6.56 mV，多分散性指数分别为0.481、0.448、0.366和0.093，包封率分别为（88.5±2.5）％、（88.7±3.2）％、（85.6±4.1）％和（80.0±4.5）％，载药量分别为（8.9±0.2）％、（8.9±0.3）％、（8.6±0.4）％和（7.9±0.4）％。以TFu溶液为对照，采用动态膜透析法分别考察四种粒径的TFu脂质体在磷酸盐缓冲液（pH7.4）以及人工胃液（pH1.2），肠液（pH6.8）中的体外释药情况，结果表明四种粒径脂质体在各介质中均有不同程度的缓释作用。以粒径为400nm的TFu脂质体为例，在PBS（pH7.4）和人工肠液中，TFu脂质体的体外释药符合双相动力学方程：100-Q=98.18e-0.2735t+40.89e-0.028t，Rα=0.9990，Rβ=0.9963；和100-Q=96.00e-0.2934t+26.53e-0.027t，Rα=0.9941，Rβ=0.9931；而在人工胃液中，TFu脂质体释放符合Weibull方程：ln[-ln（1-Q）]=0.804lnt-0.88，r=0.9915。TFu溶液在不同介质中的释放均符合一级速率方程ln（100-Q）=-0.5585t+4.037，r=0.9984；ln（100-Q）=-0.7151t+4.2232，r=0.9965和ln（100-Q）=-0.567t+4.1207，r=0.9970。稳定性考察结果表明TFu脂质体（400nm）4℃贮存12个月时药物渗漏率达37.77％，因此，为增加脂质体稳定性，制备了冷冻干燥TFu脂质体，所得TFu脂质体冻干粉粉末均匀、疏松，具有良好的再分散性。DSC验证TFu脂质体的形成，冻干后平均粒径为（438.9±10.7）nm，多分散性指数为0.651；Zeta电位为-4.3mV，包封率为（75.15±3.9）％，载药量为（7.524±0.2）％，初步稳定性实验显示其稳定性良好（9个月），达到了预期目的。4．不同粒径托氟啶脂质体口服和静注小鼠体内动力学以及体内组织分布研究粒径是决定纳米给药系统在体内吸收程度和靶向性的重要因素之一。课题以TFu混悬液组为对照，分别考察了小鼠口服四种粒径TFu脂质体后药物在体内药物动力学性质，并考察了小鼠口服脂质体（400nm）后药物在体内的分布。结果表明，脂质体粒径对药物在胃肠道的吸收有显著的影响，小鼠口服四种粒径的TFu脂质体（530nm、400nm、320nm、180nm）相对于口服TFu混悬液的生物利用度分别为160.5％，198.9％，221.6％和260.3％，TFu脂质体口服吸收的生物利用度随脂质体粒径的减小而增大，将水不溶性药物TFu制备成小粒径（180nm）的脂质体可以显著提高其口服吸收的生物利用度（p＜0.01）。小鼠口服脂质体的体内分布研究表明，脂质体在提高血药浓度的同时，也提高了某些组织的吸收，如肝、肺、脾等。以TFu50％乙醇溶液为对照，研究小鼠静注不同粒径TFu脂质体（530nm，400nm和180nm）后体内药物动力学性质，并考察小鼠静注不同粒径TFu脂质体后药物在心、肝、脾、肺、肾、脑及血浆等组织器官中的蓄积情况，并通过药动学参数和靶向性参数对脂质体进行靶向性评价。很多文献指出，脂质体静脉注射后可迅速地被体内网状内皮系统吞噬，因而选择性地分布于网状内皮系统丰富的器官，如肝和脾等，出现较高的局部药物浓度，即被动靶向。试验结果表明脂质体粒径变化显著改变了药物的体内配置：粒径范围在530nm～400nm的脂质体表现了被动靶向特性，与药物溶液相比，药物在肝、脾蓄积增加最为显著（p＜0.01；p＞0.01），心、肾蓄积明显减少（p＜0.01；p＜0.01），因而可在一定程度上减小药物可能引起的心脏毒性及肾毒性；而小粒径脂质体（180nm）由于粒径减少而避免了网状内皮系统吞噬，明显延长药物体内滞留时间，增加血药浓度，提高生物利用度，可满足长循环的要求。5．托氟啶脂质体促进TFu口服吸收的机制研究托氟啶脂质体口服可促进药物吸收，因此课题比较各种影响因素，如能量抑制剂、空白脂质体、固体分散体等，采用口服试验、小鼠外翻肠囊实验等方法对脂质体口服促吸收机理进行探讨。与对照组相比，加入空白脂质体对TFu的口服吸收无显著影响（p＞0.05）；能量抑制剂DNP可显著增加TFu的吸收，因此脂质体中TFu的小鼠小肠吸收过程可能不需要载体，非能量依赖。小鼠外翻肠囊实验结果表明，TFu脂质体单位面积吸收量呈剂量依赖，符合Fick’s扩散定律，表明TFu脂质体主要以被动扩散的方式吸收。TFu脂质体在胃／肠匀浆物中孵化24小时后包封率均有所下降，虽仍有50％以上的包封药物，但与PBS7.4缓冲液组相比，其包封率在24h分别下降17％和5％，表明脂质体在胃、肠中有部分遭到破坏，稳定性下降。小鼠外翻肠囊实验考察不同粒径TFu脂质体溶液在肠囊内、外的包封率的变化，肠管内包封率均在-1～0％范围内变化，而管外脂质体随着时间的推移，包封率均有所下降，可能TFu脂质体并不是以完整形式透过肠壁膜，主要以游离形式透过肠膜；肠壁通透性和肠吸收结果表明不同粒径脂质体在小肠内的单位吸收量和肠壁通透性有差异性变化（p＜0.01），小粒径脂质体（180nm）的单位吸收量和肠壁通透性都明显增加（p＜0.01）。为进一步了解脂质体对TFu吸收的影响，制备TFu脂质固体分散体并与脂质体比较。结果表明，小鼠口服TFu固体脂质分散体和脂质体后，其口服生物利用度无显著性差异（p＞0.05）。脂质体的双分子层结构可能没有明显的优势保护药物并促进药物口服吸收。但是药物在固体分散体中很不稳定，容易老化，放置2个月后，其释放曲线规律性很差，释放百分率变化率超过20％，影响药物的疗效，限制其广泛应用；而脂质体具有更好的稳定性、均匀性和质量可控性，便于静脉注射等，可作为良好的药物载体，开发适宜临床应用的TFu新剂型。综上，未加任何修饰的普通纳米脂质体很可能在经胃肠道吸收过程中遭到部分破坏，TFu在体小鼠小肠的口服吸收可能不需要载体，非能量依赖，推测TFu在小鼠小肠的吸收属于被动扩散。TFu主要以游离形式透过肠膜，即药物释放后再吸收，脂质体可能通过提高药物在吸收部位的分散性和溶解性，促进其在生物膜中的分散和溶解，这与粒径越小，促吸收作用越明显相一致。本课题成功研制了TFu脂质体制剂，所采用的制备工艺简便可行，重现性好，包封率较高，冻干后可以增加TFu脂质体的长期稳定性，有利于注射或口服给药。脂质体作为抗肿瘤药物载体提高了TFu生物利用度以及药物治疗指数，药物包封于脂质体后，口服吸收生物利用度明显提高（p＜0.01），并随着脂质体粒径的减小而增加。粒径范围在530nm～400nm的脂质体静脉注射可作为肝、脾靶向制剂，并在一定程度上减小药物可能引起的心脏毒性及肾毒性；而小粒径脂质体（180nm）静脉注射可实现长循环；因此制备不同粒径大小的脂质体，可以满足不同的临床治疗需要。同时，对脂质体促进药物口服吸收的机制的初步探讨，为进一步开发抗癌药物脂质体新制剂提供了一定的试验依据和理论基础。
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