玉米抗丝黑穗病分子标记开发与主效抗病基因定位

论文摘要

玉米（Zea mays L.）丝黑穗病是一种世界性病害,也是我国春玉米产区的主要病害之一。这种病害是由土壤或种子带菌传播的真菌病害,其病原菌丝轴黑粉菌（Sphacelotheca reiliana（K（u|¨）hn）Clint）在玉米幼苗期地下部分侵入、系统感染,成株期表现典型症状,在雄穗和雌穗上产生黑粉孢子。数量遗传学研究表明,玉米对丝黑穗病的抗性属数量性状遗传,同时受基因加性、显性和上位性效应控制,其中基因加性效应占主导作用,非加性效应作用较小,抗性能稳定遗传。随着分子生物学的发展,现代数量遗传学和生物技术手段也已应用于玉米丝黑穗病的抗性遗传研究。迄今,多位研究者在国内外玉米种质中发现了多个抗病基因位点（QTL）及其连锁分子标记,并获得了与丝黑穗病抗性相关的候选基因（TUGs,tentative unique genes）。这些研究结果为玉米丝黑穗病抗性基因的发掘奠定了良好基础,但现有研究结果还尚不能完全满足基因克隆及分子标记辅助育种的需要。本文围绕玉米丝黑穗病主效抗性基因精细定位及分子标记开发开展研究。主要研究内容、方法和结果如下:1.以玉米自交系为材料,采用BSA和AFLP标记相结合的方法,开发了2个与玉米丝穗病抗性相关SCAR标记。利用玉米10个主要抗丝黑穗病病自交系和10个主要感病自交系构建一组抗、感基因池。用这组抗、感基因池随机筛选101对AFLP引物,平均每对引物扩增46个片断,共扩增约4646个片断,其中由56对引物扩增的65个片断在抗、感基因池间呈现多态性。用筛选获得的56对AFLP引物分析组成抗、感池的20个自交系,经χ2独立性测验,发现7个片断似乎与丝黑穗病抗性相关,分别为P54M71-148、P44M62-331、P46M37-136、P46M37-137、P44M46-147、P38M46-137和P51M38-130。将7个片断回收、克隆和测序,经同源性分析,片断P46M37-136和P46M37-137为同源序列。对6个回收差异片断的序列设计6对引物（根据2个同源序列设计ASP引物）,然后利用抗、感基因池及其组成自交系的预扩产物和相应的基因组DNA分别对6对引物进行检验。检验结果表明,6对引物全部转化为SCAR标记,分别为S126、S258、AS136/A137、S98、S131和S100。进一步利用其它54个玉米丝黑穗病抗、感自交系对转化的6个SCAR标记进行验证。经χ2独立性测验,ASP（χc2=26.06）和S100（χc2=4.13）,表明它们与丝黑穗病抗性相关,并将其分别定位于玉米染色体的bin1.09和bin3.08区域。2.利用玉米的2个BC3回交群体,采用BSA和AFLP标记相结合的方法,开发了1个与玉米丝穗病抗性相关SCAR标记。利用2个抗玉米丝黑穗病自交系（Qi319和Mo17,供体亲本）与1个感病自交系（黄早四,轮回亲本）构建2个BC3回交群体（BC3Q群体和BC3M群体）。BC3Q群体,即齐319（高抗,供体亲本）×黄早四（高感,轮回亲本）群体;而BC3M群体,即Mo17（抗病,轮回亲本）×黄早四（高感,轮回亲本）群体。通过对2个BC3群体进行丝黑穗病抗病鉴定筛选得到抗、感极端株系,利用群体中的极端抗、感株系分别构建了两组抗、感基因池。分别利用抗、感基因池及相应的亲本自交系筛选获得了31对AFLP引物,平均每对引物扩增46个片断,共扩增约1426个片断。对于BC3Q群体,有8对引物的11个片断在抗池、抗病亲本齐319和感池、感病亲本黄早四之间呈现多态性;对于BC3M群体,有9对引物的10个片断在抗池、抗病亲本Mo17和感池、感病亲本黄早四间呈现多态性。进一步用这些多态性引物组合分析组成相应抗、感基因池的个体,经χ2独立性测验,在两个群体中初步发现共有6个片断与丝黑穗病抗性相关,分别为P12M48-215、P13M61-152、P39M46-137、P64M47-204、P13M49-185和P64M47-170。将这6个片断分别回收、克隆及测序,但片断P13M49-185没有回收成功。将其它5个片断进行同源性分析,序列P64M47-204与玉米基因组未知功能的mRNA高度同源。对回收得到的5个序列共设计了7对引物（根据P64M47-204设计3对引物）,利用相应抗、感池及组成个体的预扩产物和基因组DNA分别进行验证,只有3对引物成功转化成了SCAR标记,分别是S130、S193和S116。此后,进一步利用相应BC3回交群体中更多抗、感株系和74个玉米自交系进行验证,经χ2独立性测验,S130与丝黑穗病抗性高度相关,并将其定位于玉米染色体bin2.09区域,即研究发现的抗玉米丝黑穗病主效QTL区域。3.采用SSR和SCAR标记定位玉米抗丝黑穗病主效QTL。利用玉米染色体bin2.09主效QTL区域的5个SSR标记和新开发的SCAR标记S130完善抗病QTL区段遗传连锁图谱,获得平均间距为4.78cM的区段加密图谱。用软件Winqtl cartographer2.5的单标记分析法分析,发现该区域QTL的连锁标记有11个,分别是bnlg1520、umc1525、p3864185、p3946135、bnlg1893、umc1207、umc2184、umc2077、S130、p5138120和p3762147;利用复合区间作图法分析,发现该区域QTL连锁标记有6个,分别为umc1207,umc2184,umc2077,S130和p5138120,它们被包含于单标记分析法获得的连锁标记。继后,以6个QTL连锁标记分析2个BC3回交群体中的抗、感株系,通过比较同一群体内抗病家系和感病家系供体抗病亲本导入片断的大小,拟将玉米丝黑穗病抗性基因定位在一定的区域内。根据BC3Q群体分析结果,将位于bin2.09区域的抗病QTL定位在标记bnlg1893附近,并由标记umc1525和umc1207界定到12cM的区域;根据BC3M群体的分析结果,同时比较QTL定位及BC3Q群体的基因定位结果,推测在玉米基因组bin2.09上可能存在另1个丝黑穗病抗性基因,位于标记S130和p5138120的右侧,暂时未能被明确界定。4.基于抗病与感病玉米自交系序列差异开发了2个STS标记。首先,通过分析www.maizegdb.org网站IBM2 2008 Neighbors Frame2图谱上抗玉米丝黑穗病QTL区域内（标记umc1525和umc1207之间）的标记及相关序列,发现RFLP位点mmp195e的2个相关序列AZ916344和AZ916345均为RGA序列ZmGsstuc11.12-04.4163.2的一部分。然后对ZmGsstuc11.12-04.4163.2序列中片断AZ916344和AZ916345分别设计引物AZ44和AZ45,扩增抗、感自交系齐319、Mo17和黄早四基因组DNA。分析表明,序列AZ916344在3个自交系中序列几乎一致,而序列AZ916345在自交系Mo17,齐319与黄早四中存在2处差异明显的In/Del位点。最后针对这2处In/Del位点再次设计引物MH-1和MH-2,经检测,MH-1和MH-2能在齐319、Mo17和黄早四间得到特异性、多态性扩增产物,随即开发成为2个STS标记,并进一步定位于玉米染色体bin1.09区域。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 研究目的与意义
• 1.2 玉米丝黑穗病及其抗性遗传研究
• 1.2.1 玉米丝黑穗病的发生与危害
• 1.2.2 玉米丝黑穗病的症状
• 1.2.3 玉米丝黑穗病病原菌及其生物学特性
• 1.2.4 玉米丝黑穗病的抗性生理、发病规律及防治措施
• 1.2.5 玉米丝黑穗病的抗源鉴定
• 1.2.6 玉米丝黑穗病的抗性遗传
• 1.2.7 玉米抗丝黑穗病数量性状定位研究进展
• 1.3 数量性状基因精细定位
• 1.4 分子标记及开发方法
• 1.5 分子标记辅助选择及在作物育种中的应用
• 1.5.1 分子标记辅助选择
• 1.5.2 分子标记辅助选择在作物育种中的应用
• 1.6 实验设计方案
• 1.6.1 研究内容
• 1.6.2 技术路线
• 2 基于BSA和AFLP标记开发玉米丝穗病抗性相关SCAR标记
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 AFLP多态性片断筛选
• 2.2.2 序列的回收、克隆及分析
• 2.2.3 引物的设计与验证
• 2.2.4 玉米丝黑穗病抗性相关SCAR标记的染色体定位
• 2.3 讨论
• 2.3.1 玉米丝黑穗病抗性相关的SCAR标记开发
• 2.3.2 BSA方法的应用
• 3 采用SSR和SCAR标记定位玉米抗丝黑穗病主效QTL
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 区段加密连锁图谱构建
• 3.2.2 主效抗病QTL定位
• 3.2.3 基因精细定位
• 3.3 讨论
• 3.3.1 玉米丝黑穗病的表型鉴定
• 3.3.2 玉米丝黑穗病抗性基因
• 3.3.3 精细定位中标记及群体问题
• 3.3.4 QTL定位方法比较
• 4 基于抗病与感病玉米自交系序列差异开发STS标记
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 序列的选择
• 4.2.2 自交系Mo17,齐319与黄早四间序列多态性分析
• 4.2.3 STS引物开发
• 4.3 讨论
• 4.3.1 基于序列开发标记的方法
• 4.3.2 玉米染色体bin1.09是否存在丝黑穗病抗病QTL
• 5 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录-文章中涉及到的试验方法
• 附录1 基因组DNA提取方法-CTAB法
• 附录2 基因组DNA提取方法-SDS法
• 附录3 PCR分析方法
• 附录4 AFLP分析方法
• 附录5 变性聚丙烯酰胺胶电泳及银染方法
• 附录6 琼脂糖凝胶电泳方法
• 附录7 琼脂糖胶DNA的回收、克隆方法
• 攻读学位期间发表的学术论文目录
• 作者简历