黔江烟区烟草青枯病生防细菌的筛选鉴定及其抑菌活性产物的研究

论文摘要

本试验以烟草青枯病病原菌为防治对象,对从黔江健康烟区烟草根际土壤中分离出的87株细菌进行直接对峙筛选初步筛选,获得2株对烟草青枯病菌有较好拮抗性的细菌5D15和5B18,通过全细胞脂肪酸分析和16SrDNA分析,鉴定了两株细菌的种属；然后优化了两株生防细菌的培养基组成,制备了2株细菌的发酵产物,通过滤纸片法对粗提物再次筛选,确定了2株细菌的发酵产物都能够抑制烟草青枯病病原菌；最后用薄层层析法确定了发酵产物的柱分离条件,对2株菌的发酵产物进行硅胶柱分离,通过核磁共振波谱法、质谱法和红外光谱法鉴定了活性物质的化学组成,为烟草青枯病生物防治的研究提供了参考。主要结论如下：（1）采用系列稀释法和平板涂布法,从黔江健康烟区土样中分离出87株细菌。直接对峙试验结果表明,细菌5D15和5B18对烟草青枯病病原菌有较好的拮抗作用,拮抗半径分别达到8.4mm和10.2mm。对两株细菌进行发酵,制备其发酵产物,配成25mg/mL的粗提物溶液,进行滤纸片法抑菌试验,结果显示,菌株5D15和5B18提取物的抑菌半径分别为6.2mm和8.0mm。（2）对5D15和5B18进行全细胞脂肪酸分析和16SrDNA分析,结果表明,5D15与铜绿假单孢菌亲缘关系最近,达到99.6%,5B18与芽孢杆菌亲缘关系最近,达到99.4%。（3）通过正交试验,优化了生防细菌5D15和5B18的培养基条件。对5D15的培养基设计了四因素五水平正交试验,发现氯化钠的浓度对5D15的生长影响最为显著,当氯化钠浓度为10.0g/mL时,5D15的生长情况最好。对5B18,首先比较了牛肉膏蛋白胨培养基和马铃薯葡萄糖培养基的影响,发现马铃薯葡萄糖培养基更适合5B18的生长,设计了三因素四水平正交试验,考察了马铃薯、葡萄糖和pH三种因素对5B18的影响。结果表明,马铃薯的浓度对5B18的生长速度影响最为显著,当马铃薯浓度为350g/L时,5B18生长条件最好。（4）将5D15的发酵产物初步分成极性不同的三部分：正己烷相、二氯甲烷相和甲醇相,滤纸片法活性测试结果显示,活性组分集中于二氯甲烷相。采用薄层层析法选择分离5D15活性产物的溶剂体系和溶剂比例,结果表明,二氯甲烷和甲醇体系适于5D15活性产物的分离,分离条件为甲醇含量分别为2%、4%、6%、10%和20%的梯度洗脱。对柱分离产物进行活性追踪,发现16～25号流出物对烟草青枯病病原菌有抑制活性,然后采用结晶法进一步纯化活性产物,高效液相色谱面积归一化法结果显示,活性产物含量为76.11%。采用MIC法测得纯化产物对烟草青枯病的半抑制浓度介于40～160μ g/mL之间。核磁共振波谱分析和红外光谱分析结果表明,活性成分主要为环二肽-（酪氨酸-亮氨酸）。（5）将5B18的发酵产物初步分成极性不同的三部分：正己烷相、二氯甲烷相和甲醇相,滤纸片法活性测试结果显示,活性组分集中于二氯甲烷相和甲醇水相。采用薄层层析法选择分离5B18活性产物的溶剂体系和溶剂比例,结果表明,二氯甲烷和甲醇体系适于5D15二氯甲烷相的分离,分离条件为甲醇含量分别为4%、8%、12%和20%的梯度洗脱。对柱分离产物进行活性追踪,发现27号流出物对烟草青枯病病原菌有抑制活性,高效液相色谱分析结果显示,活性产物中主要含有13种组分。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 文献综述
• 1.1 烟草青枯病的研究
• 1.1.1 烟草青枯病的病原学研究
• 1.1.2 病害症状
• 1.1.3 浸染循环
• 1.1.4 发生条件
• 1.1.5 发病机制
• 1.2 烟草青枯病的防治
• 1.2.1 提高烟株的抗性
• 1.2.2 药剂防治
• 1.2.3 生物防治
• 1.3 农用抗生素
• 1.3.1 农用抗生素发展概况
• 1.3.2 农用抗生素研究的意义
• 1.3.3 农用抗生素的开发模型
• 1.3.4 农用抗生素的生物合成——发酵
• 1.3.5 农用抗生素的分离纯化
• 1.3.6 农用抗生素应用展望
• 1.4 论文的设计思路及研究目的
• 第2章 黔江烟区生防菌株的筛选及鉴定
• 2.1 材料
• 2.1.1 土壤样品
• 2.1.2 菌株来源
• 2.1.3 供试病原菌
• 2.1.4 实验培养基
• 2.1.5 主要仪器
• 2.1.6 主要试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 土壤细菌的分离和纯化
• 2.2.2 拮抗菌株的筛选
• 2.2.3 拮抗细菌的鉴定
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 土壤菌株的分离和纯化
• 2.3.2 拮抗菌株的筛选
• 2.3.3 菌株的鉴定
• 2.4 本章小结
• 第3章 生防菌株5D15对烟草青枯病的防效及活性产物的分离与鉴定
• 3.1 材料
• 3.1.1 供试菌株
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 主要仪器
• 3.1.4 主要试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 发酵培养基的优化
• 3.2.2 菌株的发酵
• 3.2.3 菌株发酵产物的提取
• 3.2.4 发酵产物的分离纯化
• 3.2.5 菌株发酵产物分离片段的抗菌活性测试
• 3.2.6 活性物质的鉴定
• 3.3 结果
• 3.3.1 5D15培养基的优化
• 3.3.2 发酵产物的分离纯化
• 3.3.3 活性组分的HPLC分析及结构鉴定
• 50'>3.3.4 MIC法测定活性物质的EC₅₀
• 3.4 本章小结
• 第4章 生防菌株5B18对烟草青枯病的防效及其活性产物的分离鉴定
• 4.1 材料
• 4.1.1 供试菌株
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 主要仪器
• 4.1.4 主要试剂
• 4.2 方法
• 4.2.1 发酵培养基的优化
• 4.2.2 菌株的发酵
• 4.2.3 菌株5B18发酵产物的提取
• 4.2.4 5B18发酵产物的分离纯化
• 4.2.5 菌株5B18发酵产物分离片段的抗菌活性测试
• 4.2.6 活性物质的鉴定
• 4.3 结果
• 4.3.1 5B18培养基的优化
• 4.3.2 发酵产物的分离纯化
• 4.3.3 5B18二氯甲烷相的柱分离
• 4.3.4 活性组分的HPLC分析
• 4.4 小结
• 第5章 总结
• 5.1 结果
• 5.2 讨论
• 5.3 后续工作建议
• 参考文献
• 附图
• 附图1 菌株5D15全细胞脂肪酸气相色谱图
• 附图2 5D15的16SrDNA序列
• 附图3 菌株5B18的全细胞脂肪酸分析谱图
• 附图4 5B18的16SrDNA序列
• 附图5 5D15二氯甲烷相薄层层析图
• 附图6 5D15二氯甲烷相柱分离后各组分的薄层层析图
• 附图7 5D15精提物色谱图
• 1H-NMR谱图'>附图8 5D15¹H-NMR谱图
• 附图9 5D15精提物红外光谱图
• 附图10 5B18相在各溶剂组合条件下的薄层层析图
• 附图11 5B18二氯甲烷相第27号活性片段的HPLC图
• 附表
• 附表1 菌株5B15的全细胞脂肪酸成分
• 附表2 菌株5B18的主要脂肪酸相对含量
• 附表3 牛肉膏蛋白胨培养基正交设计表
• 附表4 5D15在各种培养基组合中随时间的生长情况
• 附表5 5D15氯化钠浓度配对比较表
• 附表6 马铃薯葡萄糖培养基正交设计表
• 附表7 5B18牛肉膏蛋白胨培养基正交试验结果
• 附表8 pH配对比较表
• 附表9 5B18马铃薯葡萄糖培养基正交试验结果
• 附表10 马铃薯葡萄糖培养基配对比较表
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录