针对EphB4的小干扰RNA慢病毒载体对激光诱导的小鼠脉络膜新生血管的抑制作用

论文摘要

研究背景脉络膜新生血管（Choroidal neovascularization，CNV）是导致年龄相关性黄斑变性（Age-related macular degeneration，AMD）的患者视力丧失最常见原因，同时它也是大量病理性近视，眼组织胞浆菌病综合症，血管样条纹症和特发性息肉状脉络膜血管病变患者视力损失的主要原因。CNV生成的病理生理学表现为，脉络膜血管内皮细胞的激活，细胞外基质的改变同时还伴有内皮细胞的增生、粘附、移行等复杂的过程，其中多种正向或逆向的调节因子相互作用最终导致了CNV。抑制CNV的发生、发展及探讨其发病机制一直是眼科学者的工作热点。VEGF受体、血管紧张素（Angiopoietin，ANG）受体和Ephrin受体（Ephs）都属于内皮细胞受体酪氨酸激酶（Endothelial cell receptor tyrosine kinases，RTKs），而RTKs在血管的发生中是重要的调节分子。在CNV的研究中，研究者们注意到VEGF是促进CNV生成的最重要的因子之一，而Ephrin配体及其受体Eph也能特异性引起血管内皮细胞增殖、迁移、分化、血管生成。B族Eph受体和Ephrin配体在血管发生中通过相互间的信号传递，促进血管网形成、动静脉分化，从而建立非对称的微血管系统。虽然EphB4和EphrinB2在成熟血管中的作用研究尚少，但在组织损伤所引起的生理性或病理性的血管生成中却起了很重要的作用。研究表明，人视网膜色素上皮细胞（Retinal pigment epithelial cell，RPE）及牛脉络膜微血管内皮细胞（Choroidal microvascular endothelial cell，CEC）上均发现有EphrinB2配体和EphB4受体的表达；在RPE和CEC的共培养体系中，通过下调VEGF的表达，RPE细胞上的EphrinB2配体和EphB4受体的表达也降低。He等人发现大鼠的CNV中表达EphrinB2配体和EphB4受体，并通过玻璃体腔内注射重组的可溶性EphB4胞外域单位成分（sEphB4）抑制了CNV的形成，为进一步阐明EphrinB2/EphB4对CNV的影响奠定了扎实的基础。因此我们设想，通过玻璃体腔内注射针对小鼠EphB4基因的慢病毒载体可能抑制CNV的生成。本研究首先构建针对小鼠EphB4基因的重组短发卡RNA慢病毒载体（vshRNA），经玻璃体腔注射入激光诱导的小鼠CNV模型中，进一步观察CNV的变化情况，为探明EphrinB2/EphB4参与CNV形成的机制奠定基础。目的：1．构建并筛选出干涉效果最好的EphB4基因vshRNA慢病毒载体；2．研究小鼠EphB4基因的vshRNA慢病毒载体抑制目的基因的表达，并对小鼠脉络膜新生血管的抑制作用。方法：构建3组针对小鼠EphB4基因的vshRNA慢病毒载体及阴性对照慢病毒载体，通过Real time PCR和Weston blot进行干涉效果的筛选；用532nm激光诱导小鼠CNV模型，玻璃体腔内分别注射2μl磷酸盐缓冲液（PBS）、pGC FU-RNAi-NC-LV （1×109TU/mL）、EphB4-RNAi-LV （1×109TU/mL），未注射组为对照组。在注药后3d通过免疫荧光检测观察EphB4在眼内的表达情况，注射后14d通过组织病理学检测和脉络膜铺片观察CNV的变化情况，并通过眼底荧光造影检测3、7、14、28dCNV的动态变化情况。结果：1．Real-time PCR结果显示第1组和第3组的筛选效果均>80%；Westonblot结果显示vshRNA3诱导的EphB4蛋白表达量最少，最终选择此组作为实验组。2．免疫荧光结果显示实验组对EphB4的干涉效果明显，通过荧光素血管造影在不同时间点动态观察CNV的变化显示，实验组CNV的渗漏面积及渗漏有效点的生成明显减小，统计结果表明组间存在统计学意义，p<0.01；组织病理学及脉络膜铺片检测显示实验组较其他组CNV的高度、宽度和面积均减小，p<0.01。结论：LV-shRNA-EphB4对小鼠眼内EphB4受体的干涉效果明确，并对小鼠脉络膜新生血管产生明显的抑制作用，为进一步探讨EphB4参与CNV的作用机制提供了有力的证据。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 文献回顾
• 第一部分 针对 EPHB4 基因 SHRNA 慢病毒载体的构建和筛选
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第二部分 针对 EPHB4 基因的 SHRNA 慢病毒载体对激光诱导的小鼠脉络膜新生血管的作用观察
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢