基于微囊藻毒素处理后鲢鱼肝脏差减文库的构建和分析以及部分基因的克隆

论文摘要

随着水体富营养化的加剧,有毒蓝藻水华对水环境的危害和生物安全日益引起广泛的关注,蓝藻水华产生的各种藻毒素给人类和水生动物的健康造成巨大的威胁。其中以LR型微囊藻毒素（Microcystin-LR,MC-LR）毒性最强、出现频率最高、造成的危害最大。鲢鱼（Hypophthalmichthys molitrix）等食藻鱼类食用大量有毒蓝藻,与哺乳动物相比它们对MC具有更强的抗性,但其去毒分子机理尚未完全阐明。因此开展MC染毒后鲢鱼肝脏组织基因表达的变化以研究其去毒机理具有重要的理论和实际意义。本研究利用抑制差减杂交技术（suppression subtractive hybridization,SSH）构建了MC-LR处理后鲢鱼肝脏差减cDNA文库,对文库中序列进行了功能注释和分类,初步探明了MC-LR处理后鲢鱼肝脏的基因表达情况,并对筛选到的部分差异表达基因进行了克隆,为从分子水平阐明鲢鱼的解毒机制奠定了基础。本论文主要包括以下几方面内容:1.鲢鱼肝脏MC-LR暴露及不同时间GST表达分析实验组鲢鱼腹腔注射200μg kg-1 body weight （bwt）溶解于0.8% NaCl溶液的MC-LR,对照组鲢鱼注射等体积的0.8% NaCl溶液,并于注射毒素后1 h、3 h、5 h和10 h分别取实验组和对照组肝脏组织用于实验。以β-actin为内参照,应用半定量RT-PCR技术分析MC-LR注射后鲢鱼肝脏不同时期GST mRNA的表达差异。结果表明,MC-LR注射后肝脏GST的表达水平显著降低,其中注射1 h后GST mRNA表达量即有显著下降,说明注射毒素1 h后GST已经参与MC-LR解毒过程,因此本实验选用1 h的实验样本进行差减杂交以筛选该过程中起关键作用的基因。2. MC-LR诱导的鲢鱼肝脏SSH文库的构建及分析利用SSH技术成功构建了MC-LR处理后鲢鱼肝脏差减cDNA文库,并且正、反向差减cDNA文库分别获得2248和1686个重组子。从正、反向差减文库中随机挑选150个阳性克隆（正向文库70个、反向文库80个）进行测序,获得88条ESTs（正向文库48个、反向文库40个）。对这88个序列经GenBank检索比较分析,其中75个（正向文库44个,反向文库31个）为单一基因,其他13个为重复序列。在这75个单一基因ESTs中,有38个片段与GenBank登陆的已知基因有较高的同源性;有11个与GenBank登陆的未知基因有较高的同源性,而其余26条序列尚无同源序列。根据其功能将他们划分为不同的类别,显示与免疫相关、转运蛋白和新陈代谢酶等在MC-LR处理后基因表达发生变化的种类与数量较多,推测他们在微囊藻毒素解毒过程中起到重要作用。3.鲢鱼肝脏差异表达基因的半定量表达分析运用半定量RT-PCR技术对正反向差减文库中各三条ESTs的表达情况进行了分析。通过实验发现他们的表达情况与抑制差减杂交实验的预期结果基本一致,正向文库的三条ESTs:Fs29（尚无同源序列）、Fs59（磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因,PEPCK）和Fs70（尚无同源序列）在MC-LR处理1 h后的表达量均显著升高。反向文库的两条ESTs:Rs15（尚无同源性序列）和Rs161（蛋白质二硫键异构酶A3基因,PDIA3）在MC-LR处理1 h后的表达量均显著降低,仅有Rs2（尚无同源序列）降低但未达到显著。此结果也证明了差减文库的构建是成功的。4.鲢鱼PEPCK和PDIA3基因的克隆及其生物信息学分析采用Rapid amplification of cDNA ends（RACE）方法克隆了两条差异表达基因PEPCK和PDIA3的全长cDNA序列。鲢鱼PEPCK cDNA全长2605 bp,包括101 bp的5’端非翻译区,564 bp的3’端非翻译区,1911 bp的开放阅读框,编码636个氨基酸。序列分析结果显示,鲢鱼PEPCK与翘嘴红鲌的同源性最高,其核酸及氨基酸序列的相似性分别达到97%和99%;其次为斑马鱼,同源性均达到90%以上;与星斑川鲽的同源性最差,但核酸及氨基酸序列的相似性也分别达到77%和84%,说明鱼类PEPCK在长期的进化过程中具有很高的保守性。鲢鱼PEPCK具有与草酰乙酯结合的特有结构域以及与GTP三磷酸链结合的激酶1和激酶2基序。鲢鱼PDIA3 cDNA全长2102 bp,包括206 bp的5’端非翻译区,381 bp的3’端非翻译区,1488 bp的开放阅读框,编码495个氨基酸。序列分析结果显示,鲢鱼PDIA3与斑马鱼的同源性较高,其核酸及氨基酸序列的相似性分别达到86%和92%;与斑点叉尾鮰同源性均较低但核酸及氨基酸序列的相似性也均达到80%以上,说明鱼类PDIA3在长期的进化过程中具有很高的保守性。PDIA3包括4个硫氧还蛋白区域可能在GSH的从头合成及再生时蛋白二硫键的形成中起到作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 1 微囊藻毒素的产生、结构、毒性与危害
• 1.1 水体富营养化的形成及影响
• 1.2 微囊藻毒素的产生
• 1.3 微囊藻毒素的结构
• 1.4 微囊藻毒素的污染现状
• 2 微囊藻毒素对鱼类的毒理学效应
• 2.1 微囊藻毒素的致毒机制
• 2.2 微囊藻毒素对鱼类的致毒效应
• 3 淡水鱼类对微囊藻毒素的去除作用研究
• 3.1 鱼类对微囊藻毒素的生物净化
• 3.2 微囊藻毒素去毒机理及相关基因
• 4 抑制差减杂交技术（SSH）及其应用
• 4.1 SSH 的基本原理与技术流程
• 4.2 SSH 方法的优缺点
• 4.3 SSH 在鱼类基因克隆中的应用进展
• 5 cDNA 末端快速扩增（RACE）技术
• 5.1 RACE 的原理及方法
• 5.2 RACE 的优点和缺点
• 5.3 RACE 的应用进展
• 6 本研究的目的及意义
• 第二章 鲢鱼肝脏MC-LR 暴露及不同时间GST 表达分析
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 第三章 微囊藻毒素诱导的鲢鱼肝脏SSH 文库的构建及分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2. 结果
• 2.1 cDNA 的合成和Rsa I 酶切
• 2.2 差减效率的验证
• 2.3 抑制差减文库的建立及分析
• 2.4 EST 测序及分析
• 3 讨论
• 3.1 高质量RNA 是构建高质量文库的基础
• 3.2 SSH 文库的质量检测
• 3.3 鲢鱼肝脏参与去除微囊藻毒素的相关基因
• 第四章 鲢鱼肝脏差异表达基因的半定量表达分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果
• 2.1 正向文库F529、F559 和F570 在肝脏组织各时间点的表达
• 2.2 反向文库R52、R515 和R5161 在肝脏组织各时间点的表达
• 3 讨论
• 第五章 鲢鱼PEPCK 和PDIA3 基因的克隆及其生物信息学分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果
• 2.1 鲢鱼PEPCK 基因RACE 扩增结果
• 2.2 鲢鱼 PDIA3 基因 RACE 扩增结果
• 3 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 致谢