苦荞总黄酮的提取及体外抗肿瘤活性研究

论文摘要

苦荞麦中所含的营养成分非常复杂,主要包括生物类黄酮、高活性蛋白、氨基酸、脂肪酸、膳食纤维、微量元素等。苦荞麦中生物类黄酮的含量较高,其中以芦丁和槲皮素为主。大量的实验已经证实,苦荞生物类黄酮具有极其广泛的生理和药理活性,如抗氧化、清除自由基、抗突变、降血糖、抗炎症、抗病毒、调节免疫等功能,尤其近年来,其独特的抗癌功能越来越受到人们的关注。本文对目前常用的几种植物总黄酮提取方法进行了比对,建立了采用微波法提取苦荞总黄酮的方法,并对苦荞黄酮的主要生理功能之一----抗肿瘤活性进行了初步研究。实验中采用了热水浸提法、碱水浸提法、乙醇回流提取法、微波提取法和超声辅助提取法五种不同的提取方法从苦荞种子粉末中得到了总黄酮,使用高压液相色谱法对提取物中的总黄酮进行了定性定量的检测。结果表明,乙醇回流提取法提取总黄酮产率最高,微波和超声波提取法次之,碱水和热水浸提法总黄酮产率最低。微波法提取产率高,耗时短,具有明显的高效性,适合大规模提取苦荞生物类黄酮。利用MTT法检测苦荞总黄酮对食管癌EC9706和宫颈癌HeLa细胞的毒性效果,结果表明,苦荞总黄酮能明显抑制两株细胞的增殖,并且作用效果呈时间和剂量依赖性。在光学倒置显微镜下观察,可见细胞核固缩,形成多个膜包的凋亡小体。利用DAPI染色检测EC9706和HeLa细胞经苦荞黄酮处理后的形态变化,电镜观察细胞核,可见多个凋亡小体,表明苦荞黄酮诱导细胞发生了凋亡。经Annexin-V/PI染色后,流式细胞仪检测,发现细胞出现晚期凋亡,并且凋亡率与黄酮剂量成正相关。此外,加入不同的检测试剂后,用流式细胞术观察其对细胞周期和细胞内ROS水平的调节作用,结果表明,苦荞黄酮引起了EC9706和HeLa细胞的G2/M期周期停滞,且细胞内ROS水平呈浓度依赖性增加。Western杂交实验初步显示,苦荞黄酮能上调细胞内的促凋亡蛋白Bax以及下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量。以上结果表明,苦荞黄酮对食管癌EC9706和宫颈癌HeLa细胞都具有明显的增殖抑制效果,为进一步开发和利用苦荞黄酮药用资源提供了一定的理论依据。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 苦荞麦概述
• 1.1.1 苦荞麦的开发利用
• 1.1.2 苦荞麦的主要营养成分及其药理活性
• 1.2 黄酮类化合物概述
• 1.2.1 黄酮类化合物的命名及分类
• 1.2.2 植物中黄酮类化合物提取方法的研究概况
• 1.2.3 植物黄酮抗肿瘤研究概况
• 1.3 苦荞黄酮的研究
• 1.3.1 苦荞黄酮的药理活性研究现状
• 1.3.2 苦荞黄酮抗肿瘤研究进展及本论文立项的目的意义
• 第二章 苦荞种子总黄酮提取方法的比较研究
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 材料与试剂
• 2.1.2 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 苦荞种子总黄酮的提取
• 2.2.2 HPLC法测定苦荞黄酮的含量
• 2.3 结果
• 2.3.1 标准品的HPLC分离
• 2.3.2 样品测定
• 2.4 小结
• 第三章 苦荞总黄酮对人食管癌细胞增殖的影响
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 细胞
• 3.1.2 材料与试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 苦荞黄酮样品制备
• 3.2.2 细胞培养
• 3.2.3 苦荞类黄酮抑制EC9706细胞生长的MTT检测
• 3.2.4 倒置显微镜观察细胞生长状态
• 3.2.5 EC9706细胞核的形态学观察
• 3.2.6 细胞凋亡的流式细胞术分析
• 3.2.7 细胞周期的检测
• 3.2.8 Western blot分析
• 3.2.9 细胞内活性氧测定
• 3.2.10 统计学分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 苦荞黄酮对EC9706细胞生长的MTT检测
• 3.3.2 倒置显微镜观察细胞生长状态
• 3.3.3 EC9706细胞核的形态学观察
• 3.3.4 细胞凋亡的流逝细胞术分析
• 3.3.5 苦荞黄酮对EC9706细胞周期的影响
• 3.3.6 苦荞黄酮对EC9706细胞内活性氧的影响
• 3.3.7 Western blot分析
• 3.4 小结
• 第四章 苦荞总黄酮对人宫颈癌细胞增殖的影响
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 细胞
• 4.1.2 材料与试剂
• 4.1.3 主要仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 苦荞黄酮样品制备
• 4.2.2 细胞培养
• 4.2.3 苦荞类黄酮抑制HeLa细胞生长的MTT检测
• 4.2.4 倒置显微镜观察细胞生长状态
• 4.2.5 HeLa细胞核的形态学观察
• 4.2.6 细胞凋亡的流式细胞术分析
• 4.2.7 细胞周期的检测
• 4.2.8 细胞内活性氧测定
• 4.2.9 统计学分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 苦荞黄酮对HeLa细胞生长的MTT检测
• 4.3.2 倒置显微镜观察细胞生长状态
• 4.3.3 HeLa细胞核的形态学观察
• 4.3.4 细胞凋亡的流逝细胞术分析
• 4.3.5 苦荞黄酮对HeLa细胞周期的影响
• 4.3.6 苦荞黄酮对HeLa细胞内活性氧的影响
• 4.4 小结
• 结语
• 参考文献
• 攻读学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 个人简况及联系方式
• 承诺书