东亚三角涡虫肌球蛋白必需轻链（DjElc）基因的表达及功能分析

论文摘要

东亚三角涡虫是扁形动物门的代表动物（三肠目、无体腔）,它具有明确定义的前后轴（AP）和背腹轴（DV）以及大脑和腹神经索组成的相对简单的中枢神经系统,更有着非凡的再生能力。在本研究中,为了鉴定涡虫肌球蛋白必需轻链DjElc基因在再生中的功能,我们克隆了DjElc基因,并研究了DjElc基因在成虫和胚胎发育早期各阶段的表达模式。系统发育分析表明：肌球蛋白必需轻链DjElc具有高度保守的序列特征,有EF-Hand结构域和钙离子结合位点,与脊椎动物和无脊椎动物都有相当高的同源性,这可能是肌球蛋白必需轻链DjElc发挥作用的关键。本文运用相应的技术探索DjElc基因在涡虫生长发育和再生过程中的生物学功能,为进一步深入研究涡虫胚胎发育和再生机制、神经起源奠定基础。肌球蛋白必需轻链是构成肌球蛋白结构的关键元素,其作用主要是通过α-螺旋杠杆臂来维持肌球蛋白结构的稳定性。从涡虫cDNA文库中鉴定的DjElc cDNA为肌球蛋白必需轻链基因。整体原位杂交研究发现胚胎发育的第一阶段并没有检测到阳性信号；信号最初出现在Stage2,卵裂球均匀的分散在合胞体上,胚胎咽和胚胎表皮分化完成,这时信号定位在胚胎咽上；Stage3时胚胎摄取外卵黄,信号在胚胎咽及胚胎外壁上表达；Stage4,信号定位在胚带和胚胎咽上；Stage5、Stage6阶段,胚胎开始拉伸,早期器官初步形成信号点状分布于腹神经索、真正的咽和外围实质组织上；Stage7,肌肉组织分化、大脑缩合,胚胎丌始向幼虫变化,这时DjElc基因的表达与成虫和再生整体原位杂交结果显示一致均在大脑和中枢神经上表达并沿腹神经索延伸。以上所有结果说明该基因与肌球蛋白Ⅱ在轴突生长中所提到的功能相一致,暗示DjElc基因潜在的功能也许参与涡虫中枢神经系统CNS的再生为了进一步检测肌球蛋白必需轻链基因彻底沉默后是否导致中枢神经系统的缺失,我们筛选出干扰再生后不同时期代表性的片段,用特异的神经marker anti-SYNORF1 （3C11）进行免疫组化实验,检测发现干扰后涡虫能再生它们的神经回路,但是大脑侧枝不能正常再生、神经元轴突缺陷,特别是尾部再生头部的缺失最为明显。综上所述肌球蛋白必需轻链基因不仅对于大脑再生中轴突的延伸是必需的而且对维持神经元和神经生长相一致也是必需的。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1.1 涡虫------脑发育和再生研究的模式动物
• 1.1.1 涡虫简介
• 1.1.2 涡虫神经系统的研究
• 1.2 肌球蛋白研究进展
• 1.2.1 肌球蛋白概述
• 1.2.2 肌球蛋白轻链基因研究现状
• 1.3 课题研究意义
• 1.4 论文研究内容技术路线
• 1.4.1 生物信息学分析
• 1.4.2 涡虫DJELC基因水平的研究
• 1.4.3 反转录RT-PCR技术
• 1.4.4 涡虫DjElc基因生物学功能检测
• 1.4.5 涡虫DjElc基因蛋白水平的研究
• 1.4.6 论文研究技术路线
• 第二章 东亚三角涡虫DJELC基因的特征和进化分析
• 1.前言
• 2.材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 DjElc与pcDNA3载体的连接
• 2.2.2 序列比较与系统进化分析
• 3. 结果
• 3.1 DjElc与pcDNA3载体的连接
• 3.2 东亚三角涡虫DjElc基因的序列分析
• 3.3 东亚三角涡虫DjElc基因的进化树分析
• 4. 讨论
• 第三章 涡虫DJELC基因的表达及分析
• 1.前言
• 2.材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 Northern杂交
• 2.2.2 涡虫DjElc基因的整体原位杂交
• 3.结果
• 3.1 涡虫DjElc基因Northern杂交
• 3.2 整体原位杂交技术检测DjElc基因在涡虫不同发育时期的时空表达
• 4. 讨论
• 第四章 涡虫DJELC基因再生中的表达及定量分析
• 1.前言
• 2.材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 RNA探针的合成和标记效率检测
• 2.2.2 再生涡虫中DjElc基因的整体原位杂交
• 2.2.3 相对定量检测再生不同时期涡虫DjElc基因表达
• 3.结果
• 3.1 整体原位杂交技术检测DjElc基因在涡虫不同再生阶段的时空表达
• 3.2 相对定量检测DjElc基因在涡虫不同再生阶段的表达
• 4.讨论
• 第五章 涡虫DJELC基因再生中的干扰及定量分析
• 1.前言
• 2.材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 干扰载体的构建
• 2.2.2 含L4440-Elc的干扰载体的大肠杆菌L4440（DE3）中的诱导表达
• 2.2.3 含有DjElc基因的dSRNA对切割后涡虫再生的影响
• 2.2.4 相对定量检测再生过程中干扰不同时期涡虫DjElc基因表达量的变化
• 2.2.5 免疫组化
• 3.结果
• 3.1 L4440-Elc干扰载体的构建
• 3.2 相对定量检测D/Elc基因干扰后在涡虫不同再生阶段的表达
• 3.3 重组质粒L4440-Elc在大肠杆菌中的表达以及喂食涡虫
• 4.讨论
• 第六章 东亚三角涡虫ELC蛋白的融合表达及鉴定
• 1.前言
• 2.材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 PET-28a-DjElc重组质粒的构建
• 2.2.2 融合蛋白的诱导表达
• 2.2.3 western blot分析
• 3.结果
• 3.1 原核表达载体的构建及Western blot鉴定
• 3.1.1 PCR扩增Elc基因
• 3.1.2 PET-28a-DjElc重组质粒的双酶切鉴定
• 3.1.3 重组蛋白的表达及鉴定
• 4.讨论
• 总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录