论文摘要
帕金森病（Parkinson’s disease PD）是常见的老年神经系统变性疾病,临床以行动迟缓等运动障碍为主要表现,大多伴有情绪低落,甚至忧郁症状。少数病人出现认知功能障碍及痴呆。具有黑质进行性的多巴胺能神经元丢失和纹状体多巴胺含量显著降低的病理生化特点。但其确切的发病机制仍不清楚。目前对于PD的研究主要依赖于PD动物模型。合适的动物模型能帮助我们进一步解释疾病病因学机制,有助于新的神经保护药物和治疗策略的研究发展,所以动物模型的研究进展直接决定了帕金森病的研究进程。神经毒素1-甲基-4-苯基-1、2、3、6-四氢吡啶（1-Methyl-4-Phenyl- 1,2,3,6- etrahydropyridine,MPTP）诱导的动物模型（如猴、C57BL小鼠）在神经化学、行为学和组织病理学上的变化非常接近于临床上PD病人的症状,使得MPTP动物模型成为PD研究中最常用的经典模型。其中MPTP小鼠模型是研究PD神经病理和神经生化改变的最有用的动物模型。SAMP8（senescence-accelerated mouse prone 8）小鼠有自然衰老的特征,且生命周期短（平均10-17个月）,约4-6个月成熟期后迅速衰老;又在增龄过程中出现学习记忆障碍及情感障碍为特点。是目前公认的研究衰老和衰老相关性疾病的很好的动物模型,多用于阿尔茨海默病（AD）的研究。但SAMP8小鼠所具备的这些特点是目前PD模型研究中的任何一种动物都不具备的。众所周知PD发病与衰老密切相关,临床上PD除了运动症状外,也有认知功能障碍和情绪改变的非运动症状。因此SAMP8小鼠应用于MPTP-PD动物模型的研究会具有独特价值。但研究报道不同动物对MPTP和它的毒性代谢产物MPP+的敏感性有显著的种属差异,非人灵长类和啮齿类中C57BL小鼠是目前已知的对MPTP最为敏感的动物。PD发病机制的大量研究发现黑质的多巴胺能神经元对氧化和炎症的损伤作用非常敏感。小胶质细胞激活参与炎症和氧化损伤,在PD的发病机制中起重要作用。MPTP的PD模型研究也显示了小胶质细胞激活与黑质纹状体系统的损害相关,许多PD动物模型研究也证实抑制小胶质细胞激活的药物能减轻黑质多巴胺神经元的变性。小胶质细胞激活后,诱导型一氧化氮合酶（Inducible NitricOxide Synthase iNOS）表达增加,生成大量的一氧化氮（NO）,NO对神经元有明显的损害作用。抑制iNOS会起到神经保护作用。iNOS催生的NO除了对神经元产生毒性作用,还可上调血红素加氧酶-1（hemeoxygenase-1 HO-1）的表达生成。HO途径被认为是神经元暴露于氧化攻击下的一个主要防御机制。多数研究认为HO-1的表达具有抗氧化损伤细胞保护作用。但在同一干预处理条件下,小胶质细胞激活、iNOS和HO-1是如何表达变化的,尚未见系统的研究报道。衰老是PD最重要的危险因素之一,与PD的发生发展密切相关。动物模型研究表明,MPTP对老年动物黑质纹状体系统的损伤更严重。那么小胶质细胞、iNOS和HO-1又是如何参与衰老在PD发病中的作用机制的呢?为此,我们首先证实MPTP是否能导致SAMP8小鼠黑质纹状体系统损伤,为SAMP8小鼠应用于PD的研究奠定理论基础;同时用MPTP干预不同月龄SAMP8小鼠,探讨小胶质细胞、iNOS、HO-1和年龄相关的黑质纹状体损害的关系,揭示衰老在PD发病中作用及可能机制,为PD的发病机制研究和治疗提供一个新的思路。1 MPP+对原代培养的SAMP8小鼠中脑神经元的毒性作用目的:体外培养细胞模型是进行帕金森病研究的基本手段之一,与体内动物实验相比具有方便、快速、稳定和经济等优点,因此我们首先在体外研究MPP+对SAMP8小鼠中脑神经元的影响,为进一步的体内实验提供依据。方法:SAMP8新生1天小鼠的中脑原代培养6天,加入100μM浓度的MPP+,再培养6h、9h、12h和24h后分别对各时间点的中脑原代培养细胞进行神经元免疫荧光染色或提取蛋白测定TH水平。结果:MPP+导致原代培养的SAMP8小鼠中脑神经元形态学改变。正常对照组神经元形态完整,免疫反应性强,胞体大呈椭圆形,突起多而长且粗壮;MPP+组神经元随时间逐渐出现形态变化,MPP+后6h即可见突起不完整断续,9h突起数目减少,缩短;12h神经元胞体明显变小,24h突起多消失,神经元胞体小且免疫反应性弱。MPP+导致原代培养的SAMP8小鼠中脑神经元数量在MPP+后9h开始有显著减少,同时TH蛋白的表达也开始有显著减少,24h最低。结论:MPP+对原代培养的SAMP8小鼠中脑神经元具有毒性作用。MPP+导致SAMP8小鼠中脑神经元原代混合培养体系的神经元数量下降,同时TH蛋白表达降低,提示MPP+可导致中脑DA能神经元损伤死亡。2 MPTP致SAMP8小鼠黑质纹状体系统的急性损害目的:进一步体内研究确定MPTP是否可导致SAMP8小鼠黑质纹状体系统的损害,从行为学、病理形态学和神经生化学方面评价MPTP对SAMP8小鼠黑质纹状体系统的影响,为SAMP8小鼠应用于PD的研究提供进一步的理论依据。方法:3月龄雄性SAMP8小鼠背部皮下注射MPTP 20mg/kg/次,连续注射4次,每次间隔2小时。对照组注射生理盐水代替MPTP。第8天处死小鼠。检测小鼠自主活动次数、黑质DA能神经元数量和纹状体DA含量的变化。结果:MPTP组小鼠自主活动减少,于第1次给药后6 h达最低水平,有统计学差异P<0.05,48h后恢复正常水平。MPTP组TH阳性神经元数量（104.5±5.0973,p<0.001）较对照组（181.4±10.4530）明显减少,减少42.39%。MPTP组小鼠纹状体DA含量（162.0±68.9306nM）与对照组（815.9±87.5402nM）相比显著降低（P<0.001）,减少80.14%。结论:SAMP8小鼠背部皮下注射MPTP（20mg/kg/2h,注射4次）,行为学显示自主活动减少;病理形态学上证实了黑质DA能神经元数量显著减少,纹状体DA能神经元投射纤维明显丢失;神经生化研究显示纹状体DA含量的显著降低。MPTP可导致SAMP8小鼠黑质纹状体系统损害。3 MPTP致SAMP8小鼠年龄相关的黑质纹状体系统损害目的:选取3月龄（青年）和6月龄（中老年）的SAMP8小鼠,背部皮下注射MPTP,观察其行为学及病理形态学、神经生化学方面改变的不同,探讨衰老在PD发病中的作用。方法:3月龄和6月龄SAMP8小鼠背部皮下注射MPTP 20mg/kg/次,连续注射4次,每次间隔2小时。对照组注射生理盐水代替MPTP。观察自主活动变化。并在MPTP后6h、24h、3d和8d处死小鼠用于检测DA神经元数量和DA含量的变化。结果:两个不同月龄MPTP组小鼠自主活动减少,均于第1次给药后6 h达最低水平,有统计学差异（P<0.05）;其中3月龄小鼠48 h后恢复正常水平;但6月龄小鼠至7d时仍没有恢复正常水平（P<0.05）。3月龄小鼠TH阳性神经元减少6h（7.06%,P=0.235）,24h（12.79%,P<0.05）,3d（22.49%,P<0.01）,8d（42.39%,P<0.001）;其中3d和8d比较差异有显著性（P<0.01）,神经元的丢失以3至8天最为显著。6月龄小鼠TH阳性神经元分别减少14.23%（P<0.05）,23.85%（P<0.01）,36.77%（P<0.001）,45.9%（P<0.001）, 24h与3d比较显著性差异（P<0.05）;神经元的丢失以24h至3天最为显著。两个不同月龄组同时间点比较:MPTP 3d有显著性差异（P<0.01）。6月龄MPTP小鼠DA能神经元丢失发生早且严重。MPTP组纹状体TH-ir的COD值降低比较,3月龄小鼠24h和3d比较差异有显著性（P<0.05）。6月龄小鼠6h和24h比较差异有显著性（P<0.05）。两个不同月龄小鼠在24h,3d时间点比较差异有显著性（P<0.05）,6月龄MPTP小鼠纹状体TH-ir的COD值降低发生早且严重。MPTP组3月龄小鼠纹状体DA含量与对照组相比于6h、24h、3d、8d分别降低79.09%（P<0.001）,80.33%（P<0.001）,83.86%（P<0.001）,80.14% （P<0.001）;6月龄小鼠分别降低79.70%（P<0.001）,86.64%（P<0.001）,75.20% P<0.001),92.32%（P<0.001）。结论:MPTP导致SAMP8小鼠DA能神经元及投射纤维的变性丢失具有时间依赖性。MPTP可导致年龄相关的SAMP8小鼠黑质纹状体系统损伤,老年小鼠损伤更为严重。提示了衰老是PD易感因素,在外界损伤刺激下,衰老个体更易发生PD。4 MPTP致SAMP8小鼠年龄相关的黑质纹状体系统损害的可能机制探讨目的:检测3、6月龄SAMP8小鼠给予MPTP前后黑质纹状体小胶质细胞、iNOS和HO-1的变化,探讨它们与MPTP导致的SAMP8小鼠年龄相关的黑质纹状体系统损害的关系,揭示衰老在PD发病中的可能作用机制。方法:小鼠的选择和处理同第3部分,于MPTP后6h、24h、3d和8d处死小鼠。用免疫组织化学技术和western-blot方法检测TH、小胶质细胞、iNOS和HO-1的表达。结果:MPTP致SAMP8小鼠年龄相关的黑质纹状体多巴胺能神经元数量减少及TH蛋白表达降低,6月龄小鼠降低更为显著。MPTP导致两个不同月龄小鼠纹状体小胶质细胞激活及cd11b蛋白表达增高,且在MPTP后24h、3d时6月龄小鼠纹状体cd11b蛋白增高较3月龄小鼠增高更为显著。MPTP致纹状体区iNOS阳性细胞增多及iNOS蛋白表达增高,但各时间点两个不同月龄小鼠之间比较无明显差异。仅在MPTP后3d小鼠纹状体区见到HO-1阳性细胞,同时HO-1蛋白表达增高,余各时间点及对照组未见HO-1阳性细胞,且两个不同月龄小鼠之间比较无明显差异。中脑区小胶质细胞、iNOS和HO-1均未见显著变化。结论:在MPTP-SAMP8小鼠的急性模型中,小胶质细胞的病理变化和iNOS的表达变化主要发生在纹状体区。小胶质细胞激活在MPTP导致的SAMP8小鼠黑质纹状体系统急性损伤中起重要作用。MPTP组6月龄小鼠小胶质细胞激活较3月龄小鼠更早更显著可能与其更严重的黑质纹状体多巴胺能系统损伤有关。iNOS的表达增高参与了MPTP对SAMP8小鼠黑质纹状体的损伤,但在年龄相关性损伤中不起主要作用。在MPTP导致的年龄相关的SAMP8小鼠黑质纹状体系统急性损伤中,HO-1的高表达是一过性短暂的,它的神经保护作用有限。综上所述,我们首次在体内外证实了MPTP可导致SAMP8小鼠黑质纹状体系统损伤,产生自主活动减少,DA能神经元数量减少和DA水平显著降低等帕金森病样改变,为SAMP8小鼠应用于PD的研究奠定了理论基础。同时MPTP可导致SAMP8小鼠黑质纹状体系统的年龄相关性损害,老龄小鼠损伤更为严重,提示衰老是PD的易感因素,在外界损害刺激下,衰老个体更易发生PD。小胶质细胞激活程度不同与MPTP-SAMP8小鼠黑质纹状体系统的年龄相关性损害有关,提示这种小胶质细胞激活程度的变化可能是衰老个体对PD易感的重要作用机制之一。
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