免疫胶体金技术检测禽流感病毒的研究及初步应用

论文摘要

1.胶体金标记抗禽流感病毒核蛋白单克隆抗体用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,通过目测法及热稳定法初步判定其质量及稳定性,透射电镜下观察胶体金质量。结果显示,该方法制备的胶体金平均粒径为15.95nm,标准差为1.04,变异系数为6.53%,证明柠檬酸三钠还原法是一种简便、快速研制高质量胶体金溶液的方法。用饱和硫酸铵法对抗禽流感病毒（AIV）核蛋白（NP）单克隆抗体（7B4）腹水进行初步提纯,然后以亲和层析法进一步纯化,经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定,证明纯化后所得单抗杂蛋白含量少,纯度较高。将纯化的单抗与适量胶体金溶液混合,进行胶体金标记,并通过透射电镜观察和免疫学验证。结果表明,金颗粒周围形成明显晕圈,该标记的抗体能与相应的病毒抗原发生特异性结合,可进一步应用于禽流感免疫金快速检测试纸条的研制。2.免疫金快速检测禽流感病毒方法的初步建立以胶体金标记的抗AIV NP单克隆抗体7B4制备免疫金垫,分别以纯化好的抗AIV NP单克隆抗体及兔抗鼠IgG高免血清标记T线和C线,建立了检测AIV的免疫层析快速检测方法。制备工作条件优化结果表明,免疫金溶液二倍稀释后35ul/cm喷膜,T线为0.6ul/cm的单克隆抗体（2.62mg/ml）,C为0.6ul/cm兔抗鼠IgG高免血清（2.02mg/ml）条件下检测效果最佳,研制的试纸条不能与新城疫病毒（NDV）、传染性法氏囊病病毒（IBDV）、小鹅瘟病毒（GPV）、禽呼肠孤病毒（ARV）等发生交叉反应,而仅特异性地与AIV反应;灵敏性试验结果表明,试纸条检测法比血凝试验（HA）更敏感,当病毒的HA为2-6时,该方法在2-9稀释度仍能检出;重复性试验结果表明,批内变异系数均值为8.63%,批间变异系数最大值为9.85%,均在允许范围内。禽流感免疫金快速检测试纸条可于4℃密封保存6个月以上。3.免疫金快速检测禽流感病毒试纸条的初步应用利用免疫金快速检测禽流感病毒试纸条对来源于江苏、安徽、山东和河南等地的962份病禽组织器官样品、83份血清样品和216份泄殖腔棉拭子样品进行了检测,结果表明,在所有1261份样品中检测出225份呈阳性,阳性率为17.84%;试纸条对各脏器组织检测结果阳性率依次为卵巢、胰、腺胃、肺、肝、脾和肾。与双抗体夹心ELISA方法检测病毒抗原结果比较发现,在ELISA检测的957份病禽组织器官样品、82份血清样品和216份泄殖腔棉拭子样品中,有370份呈阳性,阳性率为29.48%。ELISA对各脏器组织检测结果阳性率依次为肺、卵巢、脾、肝、腺胃、肾和胰。比较二者结果显示,两种方法对腺胃、卵巢、血清及肛拭子的检测结果差异不大,对肺、脾、肾、胰的检测结果差异较大,其中试纸条检测胰的阳性率较ELISA检测率高,而ELISA检测肺、脾、肾的阳性率较试纸条检测率高;综合两种方法检测结果提示,肛拭子和肺是检测的首选样品。进一步研究发现,试纸条平行检测鸡胚分离培养鉴定为阳性的样品,结果符合率为92.3%（12/13）,证明本研究所建立的方法特异性强、灵敏性高。应用该试纸条检测样品仅需3-10min,与传统的病毒分离检测方法相比,能明显的缩短检测时间,操作简便,利于推广应用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 综述：禽流感诊断技术及胶体金检测技术研究进展
• 一、禽流感诊断技术研究进展
• 二、胶体金检测技术研究进展
• 参考文献
• 研究内容一：胶体金标记抗禽流感病毒核蛋白单克隆抗体
• 1、材料和方法
• 2、结果
• 3、讨论
• 参考文献
• 研究内容二：禽流感免疫金快速检测方法的初步建立
• 1、材料和方法
• 2、结果
• 3、讨论
• 参考文献
• 研究内容三：免疫金快速检测禽流感试纸条的初步应用
• 1、材料和方法
• 2、结果
• 3、讨论
• 参考文献
• 本研究主要成果
• 致谢