论文摘要
背景和目的:急性肺损伤（Acute lung injury,ALI）是临床常见的呼吸系统急危重症之一,感染是该病的主要诱因,革兰氏阴性杆菌感染致ALI,主要是由于内毒素（Endotoxin）的主要成分脂多糖（Lipopolysacharide,LPS）活化炎性细胞释放大量炎症细胞因子所致。肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages,AMs）是呼吸道的重要防线,亦是LPS的主要效应细胞。研究其LPS致伤作用的信号通路及阻断效应,对帮助了解ALI的发生机制,寻找ALI治疗的新靶位,具有重要的理论和实际意义。核仁素是一种穿梭蛋白,它可以自由穿梭于细胞核、细胞浆和细胞膜之间,它参与了细胞周期的调节,并在病原微生物的感染和自身免疫系统疾病中也发挥一定的作用。核仁素可以帮助病原微生物粘附于宿主细胞并进入宿主细胞,这使核仁素成为抗微生物感染的新的治疗靶点。目前,有研究报道,在外周血的单核细胞THP-1细胞膜表面也有核仁素表达和分布,并参与了LPS诱导的炎症因子TNF-α和IL-6的产生和释放,其具体的信号传导途径尚未阐明。AMs是来源于外周血的单核细胞,核仁素在其细胞膜表面是否有表达,以及是否参与了LPS对AMs的激活尚未见文献报道。本研究旨在通过检测大鼠肺泡巨噬细胞膜表面核仁素的表达分布变化,观察膜核仁素与LPS的相互作用,探讨膜核仁素在LPS激活AMs中的作用,初步阐明其在LPS致急性肺损伤中的作用及机制。方法:1.检测大鼠肺泡巨噬细胞膜核仁素的表达采用支气管肺泡灌洗法分离获得大鼠肺泡巨噬细胞。应用免疫荧光激光共聚焦法及流式细胞术检测大鼠肺泡巨噬细胞膜表面核仁素的表达。2.观察肺泡巨噬细胞膜核仁素与LPS相互作用应用亲和层析法,制备LPS的亲和层析柱,分离纯化与LPS结合的肺泡巨噬细胞膜结合蛋白。ELISA法检测LPS与核仁素的结合反应。采用双重免疫荧光法,用FITC标记的LPS以及Cy3标记的核仁素抗体共同孵育肺泡巨噬细胞,观察二者在细胞内的共定位情况。流式细胞术分析核仁素抗体对肺泡巨噬细胞结合LPS的影响。3.LPS诱导下肺泡巨噬细胞核仁素的基因和膜蛋白表达变化用RT-PCR和Western blot的方法分别检测LPS诱导下肺泡巨噬细胞核仁素mRNA和膜核仁素蛋白在不同时相点上的表达变化。用RT-PCR和Western blot法分别检测不同浓度的LPS诱导下肺泡巨噬细胞核仁素mRNA和膜核仁素蛋白的表达变化。4.体外转染核仁素RNAi表达载体对LPS激活肺泡巨噬细胞作用的实验研究分离、培养大鼠肺泡巨噬细胞,在LPS刺激前予以转染pBS-U6.C23shRNA。免疫荧光及激光共聚焦观察LPS内化入肺泡巨噬细胞情况。Western blot检测膜核仁素蛋白表达。EMSA检测肺泡巨噬细胞NF-κB活性。ELISA检测培养上清液中TNF-α和IL-6表达。5.体内转染核仁素RNAi表达载体对LPS肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞活化的影响SD大鼠麻醉后行气管插管,气管内滴入pBS-U6.C23shRNA,对照组滴入pBS-U6.controlshRNA,48h后予以尾静脉注射LPS,复制急性肺损伤模型。取左下肺行HE染色。肺泡灌洗分离培养肺泡巨噬细胞,Western blot检测肺泡巨噬细胞膜核仁素蛋白表达;EMSA检测肺泡巨噬细胞NF-κB活性;ELISA检测肺泡灌洗液中TNF-α和IL-6表达。结果1.成功分离培养大鼠肺泡巨噬细胞,免疫荧光染色和流式细胞术均观察到大鼠肺泡巨噬细胞膜表面有核仁素表达。2.通过亲和层析法分离纯化得到LPS膜结合蛋白核仁素,膜核仁素可以与LPS直接结合,ELISA检测显示二者的结合反应呈浓度依赖性增加。同时,运用双重荧光共定位法观察到核仁素与LPS 1h后共定位于细胞膜上,4h后共定位于细胞浆内,流式细胞术检测发现抗核仁素的抗体显著抑制了LPS与肺泡巨噬细胞结合。3.正常未受刺激的细胞即可见核仁素mRNA和膜核仁素蛋白表达。1ug/ml的LPS刺激肺泡巨噬细胞,1h后核仁素的mRNA表达开始升高,4h达到高峰,随后逐渐减弱;膜核仁素的蛋白表达2h开始升高,8h达到高峰,12h后逐渐下降。用不同浓度的LPS刺激肺泡巨噬细胞,实验组核仁素的mRNA和膜核仁素蛋白表达显著高于对照组（P<0.01）,而且随着LPS浓度的增加,其表达呈浓度依赖性增强,当LPS浓度达到100ug/ml时,继续增加LPS的浓度,核仁素mRNA和膜核仁素蛋白表达不再增加。4.LPS刺激后的未转染及转染pBS-U6.controlshRNA对照组的细胞膜核仁素蛋白的表达、LPS的内化、NF-κB的活性以及上清液中TNF-α和IL-6的含量均较未刺激细胞增强（P<0.01） ;转染pBS-U6.C23shRNA组的细胞与未转染组及转染pBS-U6.controlshRNA组相比,以上指标均明显降低（P<0.01）。5.气道内转染pBS-U6.C23shRNA或pBS-U6.controlshRNA 48h后,大鼠生长状态良好。LPS肺损伤模型建立后行肺泡灌洗,与对照组相比,未转染组和转染pBS-U6.controlshRNA组的肺病理损伤、肺泡巨噬细胞膜核仁素的蛋白表达、NF-κB的活性以及肺泡灌洗液中TNF-α和IL-6的含量均显著升高（P<0.01） ;转染pBS-U6.C23shRNA组肺泡巨噬细胞膜核仁素的蛋白表达明显下调,干扰效果达72%;肺病理损伤评分、NF-κB的活性以及肺泡灌洗液中TNF-α和IL-6的含量均明显低于未转染组和转染pBS-U6.controlshRNA组（P<0.01）。结论:1.正常大鼠肺泡巨噬细胞膜表面表达有核仁素,LPS可以增强核仁素mRNA和膜核仁素蛋白的表达。2.肺泡巨噬细胞膜核仁素可能是LPS的一种新的膜结合受体,它参与了LPS的内化。3.膜核仁素协助LPS进入细胞内后,可以激活核转录因子,诱导炎症因子TNF-α和IL-6的产生和释放,膜核仁素参与了LPS致伤作用的信号传导。4.气管内滴入法可以安全有效转染pBS-U6.C23shRNA,降低肺泡巨噬细胞膜核仁素蛋白表达,减弱核因子活性,减少TNF-α和IL-6的生成,减轻肺损伤。
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