绒山羊皮肤干细胞定位、迁移及次级毛囊生长期差异表达基因文库的构建与筛选

论文摘要

本论文旨在研究绒山羊皮肤干细胞的分布位置及迁移轨迹,构建生长期和休止期次级毛囊差异表达基因文库,筛选与绒山羊次级毛囊生长相关的特异表达基因,从而揭示产绒动物不同类型的毛囊干细胞的行为特征、定位分布、相互关系,特别是尚未见报道的次级毛囊的干细胞生物学特性,为建立毛囊干细胞休眠、增殖、迁移、分化和决定等生命活动过程和机制的模式提供方法和理论依据。选择体态相近、健康的周岁绒山羊,分成两组:标记BrdU的实验组和未标记BrdU的对照组。根据干细胞的慢周期特性,对绒山羊表皮细胞DNA进行BrdU标记,定期取背部皮样,4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋切片,免疫组化检测,结果前10周内BrdU结果呈阳性。8周,BrdU标记细胞主要位于初级、次级毛囊的毛球部,毛干也有分布;810周,BrdU标记细胞仅位于初、次级毛囊的外根鞘;10周后无阳性信号分布。选择BrdU标记8周和810周的绒山羊背部皮样,分离酶II 4℃消化3小时,分离完整毛囊。分别用分段培养法和IV型胶原粘附法对毛囊标记细胞（毛球部和毛囊中段）进行培养,能形成典型的干细胞克隆,且细胞直径较小,核质比较大,符合皮肤干细胞的形态学特征。用皮肤干细胞的标志分子P63对BrdU标记细胞进行免疫组化鉴定,发现BrdU标记滞留细胞呈阳性。以上结果证明BrdU标记滞留细胞即为皮肤干细胞,初步确定干细胞位于初级、次级毛囊的毛母质和外根鞘,在表皮基底层也有分布。为进一步阐明次级毛囊周期性重建过程中干细胞分化启动-休眠的调控基因,以生长期和休止期次级毛囊为研究对象,利用抑制性消减杂交技术,构建了具有高消减效率的生长和休止期次级毛囊的cDNA文库。挑取20个阳性克隆,用Nested PCR Primer 1和2R进行PCR扩增,插入片段长度主要分布在2501000 bp之间。随机挑取正、反向两个差异表达基因文库中的单克隆各750个进行PCR扩增、测序,分别获得309条和344条有效序列,平均长度分别为693bp和596bp。将其进行同源性分析,各获得224个和300个nucleotide数据库中山羊及其他物种的已知存在序列同源。在EST数据库中分别找到76个、38个相似EST序列,还有9个和6个无同源性序列。在GenBank数据库共注册非冗余ESTs 126条,序列号为6497002564970150。对已知功能基因的ESTs进行分类,正反库中细胞分裂类各为15个和13个、细胞信号类为44个和49个、细胞结构蛋白30个和52个、细胞防御类13个和21个、代谢类24个和46个、基因/蛋白表达类33个和37个、未分类的65个和82个。在此基础上,进行了两次荧光交换的cDNA芯片杂交,以筛选差异表达基因。发现6个次级毛囊生长期的差异基因,其中上调基因3个,下调基因3个;10个次级毛囊休止期的差异基因,其中上调基因9个,下调基因1个。总之,本研究首次用BrdU活体标记追踪的方法证明绒山羊初级、次级毛囊及表皮中均存在皮肤干细胞;首次建立了用SSH方法分离绒山羊次级毛囊生长和休止期差异表达基因的方法,并结合荧光交换的cDNA芯片杂交来筛选。所发现的差异表达基因对阐明绒山羊毛囊干细胞休眠维持和分化启动的可能分子机制、探索干细胞技术在将来动物分子育种和绒毛生产中应用的可能性提供方法和理论依据,但对这些差异表达的基因尤其是功能未知的基因在绒毛生长中的确切生物学功能仍需进一步深入研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 皮肤和毛囊的基本结构
• 1.2 哺乳动物毛囊的胚胎发生与分子调控
• 1.2.1 哺乳动物毛囊的胚胎发生
• 1.2.2 哺乳动物毛囊形态发生相关的信号分子
• 1.3 毛囊的周期性变化与分子调控
• 1.3.1 毛囊的周期性
• 1.3.2 毛囊周期性变化的分子调控
• 1.4 绒山羊绒毛生长发育研究现状
• 1.4.1 绒山羊毛被特点
• 1.4.2 内蒙古绒山羊皮肤和毛囊的结构特征
• 1.4.3 内蒙古绒山羊皮肤和毛囊的形态发生
• 1.4.4 内蒙古绒山羊毛囊的周期性变化
• 1.4.5 绒山羊绒毛生长调控研究
• 1.5 皮肤干细胞研究进展
• 1.5.1 皮肤干细胞的定义及其生物学特性
• 1.5.2 皮肤干细胞的表面标志分子
• 1.5.3 皮肤干细胞的分布位置
• 1.5.4 皮肤干细胞的分离
• 1.5.5 微环境对皮肤干细胞增殖分化的调控
• 1.5.6 皮肤干细胞的可塑性
• 1.5.7 皮肤干细胞的应用
• 1.6 筛选差异表达基因的研究进展
• 1.6.1 基因水平筛选差异基因
• 1.6.2 蛋白质水平筛选差异基因
• 1.7 生物信息学的分析方法
• 1.7.1 生物信息学常用数据库
• 1.7.2 生物信息学的基本研究内容
• 1.7.3 生物信息学研究热点
• 1.7.4 生物信息学的发展趋势
• 1.7.5 生物信息学的应用
• 1.8 本研究的目的与意义
• 2 研究一 绒山羊皮肤干细胞定位、迁移的初步研究
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验试剂与药品
• 2.1.2 实验仪器与设备
• 2.1.3 主要液体的配制
• 2.1.4 实验动物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 BRDU 活体标记
• 2.2.2 绒山羊皮肤组织石蜡切片的制作
• 2.2.3 SAPIC法染色
• 2.2.4 HE 染色
• 2.2.5 免疫组织化学S-P 法检测BRDU
• 2.2.6 BRDU 标记滞留细胞的体外分离培养及初步鉴定
• 2.3 结果
• 2.3.1 皮肤切片的SAPIC法染色和HE 染色
• 2.3.2 BRDU 标记细胞的分布
• 2.3.3 BRDU 标记滞留细胞的体外分离培养及初步鉴定
• 2.3.4 绒山羊皮肤干细胞的定位
• 2.4 讨论
• 2.4.1 BRDU 标记绒山羊皮肤组织的体会
• 2.4.2 绒山羊初级、次级毛囊体外分离的体会
• 2.4.3 BRDU 标记绒山羊皮肤干细胞的可行性
• 2.5 小结
• 3 研究二 绒山羊次级毛囊重建前后差异表达基因CDNA 文库的构建及评价
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验试剂与药品
• 3.1.2 实验仪器与设备
• 3.1.3 实验动物
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 绒山羊生长期和休止期次级毛囊的分离
• 3.2.2 生长期和休止期次级毛囊总RNA 的提取
• 3.2.3 次级毛囊总RNA 的检测
• 3.2.4 RNA 溶液的保存
• 3.2.5 CDNA 的合成
• 3.2.6 RSA I 酶切及其效率验证
• 3.2.7 接头连接
• 3.2.8 第一次消减杂交
• 3.2.9 第二次消减杂交
• 3.2.10 第一次PCR 扩增
• 3.2.11 第二次PCR 扩增
• 3.2.12 PCR 产物纯化
• 3.2.13 PCR 产物与质粒载体连接与转化
• 3.2.14 单克隆检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 绒山羊次级毛囊消减文库构建策略
• 3.3.2 次级毛囊总RNA 的产量和纯度鉴定
• 3.3.3 SMART CDNA 的合成
• 3.3.4 RSAI 酶切效果验证
• 3.3.5 消减杂交前后的第二次PCR 产物的检测
• 3.3.6 差异表达基因CDNA 片段的T/A 克隆
• 3.3.7 差异表达基因 CDNA 片段的克隆和鉴定
• 3.4 讨论
• 3.4.1 总 RNA 分离的体会
• 3.4.2 SMART 技术合成CDNA 的优势
• 3.4.3 抑制性消减杂交技术（SSH）及构建 SSH 消减文库的体会
• 3.4.4 T/A 克隆
• 3.5 小结
• 4 研究三 绒山羊次级毛囊重建前后 CDNA 消减文库测序及分析
• 4.1 实验材料
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 CDNA 消减文库测序
• 4.2.2 CDNA 消减文库的生物信息学分析
• 4.3 结果
• 4.3.2 消减文库序列的生物信息学分析
• 4.3.3 新序列的核酸提交信息
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 5 研究四 CDNA 表达谱芯片筛选绒山羊绒毛生长相关的基因
• 5.1 实验试剂与药品
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 RNA 的提取及鉴定
• 5.2.2 对样品 RNA 进行荧光标记
• 5.2.3 杂交与清洗
• 5.2.4 芯片扫描
• 5.2.5 芯片图像的采集与数据分析
• 5.3 结果
• 5.3.1 TOTAL RNA 质检结果
• 5.3.2 纯化后 PCR 产物
• 5.3.3 芯片杂交结果
• 5.4 讨论
• 5.4.1 应用 CDNA 芯片与SSH 结合筛选绒山羊绒毛生长相关的差异表达基因
• 5.4.3 休止期次级毛囊差异表达基因
• 5.5 小结
• 6 论文总体结论
• 7 本研究的创新之处
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介