嗜热链球菌胞外多糖的分离纯化及抗肿瘤活性的研究

论文摘要

本论文以一株采自西藏雪莲的嗜热链球菌为研究对象,确定了该菌株产胞外多糖（exopolysaccharide, EPS）的最佳条件,并对其所产的胞外多糖进行分离纯化,研究其体外抗肿瘤特性。为乳酸菌胞外多糖功能性研究提供了理论依据。该菌株产胞外多糖的最佳培养基为改良IRIE培养基,根据单因素实验结果设计L9（33）正交试验,确定最佳培养条件为接种量3%,42℃发酵48h；控制pH6.0时EPS的产量比未控制pH的提高了约11.2%；Sevag法对发酵液洗脱蛋白三次,多糖得率为46.73%,脱掉59.87%的蛋白；选取分子量为5kDa的超滤膜对脱蛋白后的上清液进行浓缩过滤,膜通量为15.3L/m2·h,透过液中EPS含量为24.7mg/L；截留液浓缩4倍后,添加3倍乙醇对多糖进行沉淀,多糖产量为367.8mg/L。粗多糖依次经过DEAE-Sepharose52离子交换层析和Sepharose CL-6B琼脂糖凝层析分离纯化,得到EPS1、EPS2、EPS3,且EPS1中包含两个组分EPS1a和EPS1b,并初步确定EPS3为多糖-蛋白复合物。经HPLC测定,EPSla、EPSlb、EPS2和EPS3的纯度分别为97.0%、91.59%、91.58%和96.1%,且平均相对分子量分别为6.42×102Da,3.48×103Da、3.35×104Da和5.63×103Da。体外实验表明,EPS纯化所得各组分对人宫颈癌Hela细胞生长具有明显的抑制作用,浓度越大,抑制率越高,且浓度为500μg/mL时达到最大的抗肿瘤活性。其中EPS1a的抗肿瘤活性最高,抑制率为25.3%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 西藏雪莲嗜热链球菌
• 1.1.1 乳酸菌
• 1.1.2 西藏雪莲简介
• 1.1.3 西藏雪莲嗜热链球菌
• 1.2 多糖
• 1.2.1 多糖的简介
• 1.2.2 微生物胞外多糖
• 1.3 乳酸菌胞外多糖的研究现状
• 1.3.1 乳酸菌胞外多糖
• 1.3.2 乳酸菌胞外多糖的分类
• 1.3.3 乳酸菌胞外多糖的结构的研究进展
• 1.3.4 乳酸菌胞外多糖的化学组成
• 1.3.5 乳酸菌胞外多糖的生物合成
• 1.3.6 乳酸菌胞外多糖的分离纯化和纯度鉴定
• 1.3.7 乳酸菌胞外多糖的生理特性
• 1.3.8 乳酸菌胞外多糖的应用
• 1.4 研究的目的和意义
• 1.5 本课题主要研究内容
• 第二章 嗜热链球菌胞外多糖发酵条件的优化
• 2.1 前言
• 2.2 材料与设备
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 试剂
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 实验设备
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 多糖含量的测定
• 2.3.2 不同培养基对EPS产量的影响
• 2.3.3 培养条件对EPS产量的影响
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 培养基的选择
• 2.4.2 培养条件对EPS产量的影响
• 2.5 本章小结
• 第三章 嗜热链球菌胞外多糖的分离纯化研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料与设备
• 3.2.1 试剂
• 3.2.2 主要仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 EPS提取纯化工艺流程
• 3.3.2 蛋白质含量测定
• 3.3.3 多糖含量测定
• 3.3.4 EPS得率和提取率的计算
• 3.3.5 脱蛋白方法
• 3.3.6 超滤浓缩
• 3.3.7 嗜热链球菌EPS醇沉条件的确定
• 3.3.8 DEAE-Sepharose 52纤维素层析柱分级纯化
• 3.3.9 Sepharose CL-6B凝胶层析柱纯化
• 3.3.10 多糖纯度鉴定和分子量分布测定
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 除蛋白方法的比较
• 3.4.2 超滤浓缩
• 3.4.3 乙醇沉淀多糖
• 3.4.4 DEAE-Sepharose 52离子交换柱层析
• 3.4.5 Sepharose CL-6B柱层析
• 3.4.6 HPLC对EPS的纯度鉴定和相对分子量分布测定
• 3.5 本章小结
• 第四章 嗜热链球菌胞外多糖体外抗肿瘤活性研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料与设备
• 4.2.1 试剂
• 4.2.3 仪器设备
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 肿瘤细胞的复苏、传代、冻存
• 4.3.2 嗜热链球菌胞外多糖不同组分对Hela细胞的体外抑瘤作用
• 4.3.3 细胞形态学观察
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 MTT结果与分析
• 4.4.2 嗜热链球菌胞外多糖对Hela细胞形态变化影响
• 4.5 本章小结
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢