论文摘要
目的:肿瘤干细胞理论认为肿瘤组织中存在少量肿瘤细胞能充当干细胞的角色,在肿瘤的发生、发展、复发、转移中起着决定性的作用。目前,肿瘤干细胞已成为肿瘤研究的热点问题,而如何将肿瘤干细胞从肿瘤组织或细胞群中准确的分离纯化、培养和鉴定,这是研究肿瘤干细胞最基本的条件。最近有一种不依赖细胞表面标志物的干细胞分离方法——SP（side population）细胞分离法,正越来越多地为广大研究者应用。SP细胞,又称为边缘群细胞、侧群细胞,是指一类能够将进入细胞核的亲脂性染料排出胞外的细胞。该表型细胞在紫外光激发下,表现低荧光的特性,应用流式细胞仪就可将其分选出来。研究表明,该细胞群富含干细胞,表达干细胞的标志物,具有干细胞的特性,并广泛存在于人和动物的多种成体组织、实体瘤及肿瘤细胞系中。本实验旨在鉴定人胃肿瘤细胞系BGC-823、MGC-803中是否含有SP亚群,进一步观察SP细胞的形态特点,并研究该表型细胞与干细胞标志物ABCG2以及其同属ABC转运蛋白ABCA3、ABCB1的关系,为进一步分离和研究胃癌干细胞提供线索和基础。方法:1、将生长状态良好的BGC-823、MGC-803细胞经DNA结合染料Hoechst33342染色,于荧光显微镜下经紫外光激发观察细胞染色情况,并观察拒染或浅染的SP细胞的形态特点,计算其百分比;2、取对数生长期的培养细胞BGC-823、MGC-803,分别提取其总RNA进行RT-PCR分析,检测ABC转运蛋白家族成员ABCA3、ABCB1、ABCG2的表达情况;3、将培养的BGC-823细胞做细胞爬片,应用Hoechst33342对细胞进行染色,固定,用小鼠抗人的ABCG2单克隆抗体或山羊抗人的ABCA3多克隆抗体作为一抗,FITC标记的山羊抗小鼠或兔抗山羊的荧光二抗对爬片细胞进行免疫荧光染色,于荧光显微镜下观察Hoechst33342染色强度和ABCG2、ABCA3的表达情况。结果:1、Hoechst33342荧光染色的结果证实胃癌BGC-823、MGC-803细胞系中确有SP细胞存在,该类细胞体积较小,在两细胞系中的比例分别约为1.8%、1.4%。2、RT-PCR结果显示ABCA3、ABCG2在胃癌BGC-823、MGC-803细胞系中均为阳性表达,而ABCB1未见明显表达。3、免疫荧光染色进一步证实了部分胃癌BGC-823细胞表面有ABCG2的表达,且ABCG2+细胞即为SP细胞。结论:1、胃癌细胞株BGC-823、MGC-803中存在SP细胞,其体积较小,含量约为1～2%。2、胃癌细胞株BGC-823、MGC-803中存在ABCA3+、ABCG2+的细胞。3、SP表型细胞表达干细胞标志物ABCG2。
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