论文摘要
研究目的:应用基于核磁共振（NMR）的代谢组学方法研究荷叶生物碱干预非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）大鼠的血浆、尿液代谢表型改变及其与常规检查的相关性,来探讨NAFLD的代谢机制及荷叶生物碱干预NAFLD的相关作用机理及靶点。并通过流行病学调查探讨本地区NAFLD患者中医证候病机分布规律,应用代谢组学技术研究与正常人与NAFLD患者以及NAFLD不同中医证型患者之间的尿液代谢表型的差异及其与常规检查的相关性,以探讨代谢组学在NAFLD的早期诊断以及主要中医证候实质研究中的应用。研究方法:实验研究:采用酸水提取法最佳工艺提取荷叶生物碱。选用SD雄性大鼠,采用小剂量四氯化碳（CCl4）皮下注射结合高脂饮食复制NAFLD模型,实验分为空白组、模型组、高脂饲料组、东宝肝泰组、荷叶生物碱高、低剂量组6组。给药组分别以高、低剂量荷叶生物碱和东宝肝泰干预5周,实验结束后收集血浆及尿液,分别测定1H-NMR谱并进行主成分分析,同时进行血清、肝匀浆生化等指标测定和肝脏、肾脏组织病理学检查。临床研究:采用现场调查方式,让调查对象填写调查问卷,收集NAFLD病例,并采用国内外公认标准,构建中医证候四诊合参数据库,并检测相关指标,用SPSS 11.0统计软件分析其相关性,以研究NAFLD的发生状况、临床表现、影响因素,中医证候分布情况等。并对16例正常人与61例NAFLD患者的尿液进行代谢组学分析,测定尿液的1H-NMR谱并进行PCA分析,结合血生化指标,进行综合分析,以研究NAFLD患者的代谢表型的改变及主要中医证候的代谢特征。研究结果:实验研究:1、在本研究中,采用皮下注射小剂量40%四氯化碳豆油溶液皮下注射结合高脂饲料喂养可成功复制NAFLD模型。荷叶生物碱对NAFLD有一定的治疗作用。血清、肝匀浆生化等指标显示,荷叶生物碱能明显改善病变大鼠血脂代谢紊乱以及肝脏脂质蓄积;并能降低肝匀浆MDA的含量,对于氧化应激、脂质过氧化损伤也具有一定保护作用。形态学指标显示荷叶生物碱能减轻非酒精性脂肪肝病变大鼠肝脏脂肪性病变、炎症坏死。2、各组大鼠血浆1H-NMR谱均有明显的差别,经高脂饲料及小剂量CCl4皮下注射结合高脂饮食造模后,血浆中类脂（主要为VLDL）,类脂（主要为LDL）,类脂,乳酸等主要代谢物峰改变明显,较正常组含量明显降低。而经荷叶生物碱高、低剂量给药干预后,血浆中类脂（主要为VLDL）,类脂（主要为LDL）,类脂等主要代谢产物含量明显增高,其血浆代谢表型有向正常范围回归的趋势,呈现代谢网络修复的结果。与生化、病理等指标改变一致,并且其敏感性优于常规检查。3、NCG组与MCG、GCG组,模型对照组与给药组,以及给药组DCG组与HHG组之间大鼠尿液1H-NMR谱有明显差别,造模后,尿液中马尿酸,α-酮戊二酸,柠檬酸等较正常组含量明显降低,而肌酸酐,丙酮等含量明显增高,其中MCG组肌酸,GCG组乙酸含量也明显增高。而经各给药组干预后,尿液中丙酮,肌酸,肌酸酐等主要代谢产物含量明显降低,而N-氧化三甲胺等含量明显增高,其尿液代谢表型有向正常范围回归的趋势,呈现代谢网络修复的结果。临床研究:本地区112例NAFLD患者证候分布与痰湿相关的64例,占57.1%;与肝相关的48例,占42.9%;与脾相关38例,占33.9%;与肾相关的4例,占3.6%。NAFLD与饮食失节,贪逸少劳,情绪急躁焦虑及胆系疾病等密切相关。病性上实证居多,痰湿内阻为最多见证型。各类症状与痰湿相关的占显著比例,其次为肝,再次为脾,与肾相关的较少。正常对照组与NAFLD组,以及与NAFLD组各主要证型组之间尿液1H-NMR谱及PCA分析结果有明显差别。NAFLD组各主要中医证型的1H-NMR谱及PCA分析结果差异不甚明显,但仍有互相区分开的趋势。与NAFLD组及NAFLD组主要证型痰湿内阻型、肝郁脾虚型、肝郁气滞型相比,正常人肌酸酐谱峰相对积分面积较高,差异最为明显。研究结论:本研究将代谢组学技术与NAFLD中医证候及中药的活性成分干预NAFLD相关机理研究进行有机的结合,通过临床与实验研究,探讨NAFLD的代谢机制及荷叶生物碱作用机理,以及NAFLD主要证候的实质,取得了一定的成果,目前国内外无相关报道。荷叶生物碱主要通过调节机体脂质代谢、能量代谢紊乱,缓解氧化应激、脂质过氧化损伤等作用,能够抑制大鼠肝脏脂肪性病变、炎症反应以及肝脏胶原沉积,对大鼠非酒精性脂肪肝病具有一定治疗作用。大鼠尿液、血浆的代谢表型与造模方式及给药的不同密切相关。本地区NAFLD病位在肝,与脾、胃、胆、肾等脏腑相关,与痰湿关系密切。本病病性上实证居多,兼见本虚标实,本虚以脾虚为主,标实主要与痰湿相关。NAFLD患者尿液的代谢谱明显偏离正常人群,有望建立NAFLD早期诊断新方法,进行NAFLD发病机理研究。代谢组学分析方法在疾病诊断及药物作用机制研究等领域中有着广泛的应用前景。
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