TGEV S基因减毒鼠伤寒沙门氏菌重组活载体疫苗株的初步构建

论文摘要

本研究成功克隆了猪传染性胃肠炎SC-H株S蛋白A、D抗原位点基因S1和热敏肠毒素B亚单位基因LTB,并构建了S1及与LTB融合的重组表达载体pYA3342-S1和pYA3342-LTB-S1。将构建的重组质粒依次转化减毒沙门氏菌X3730和X4550,获得了2株能稳定表达TGEV S蛋白减毒鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）疫苗株,为TGEV口服活载体疫苗的开发研究奠定了基础。1.猪传染性胃肠炎S1基因片段和热敏肠毒素B亚单位基因的克隆本实验根据已发表的TGEV SC-H株S基因cDNA序列设计并合成一对特异性引物,以pMD19T-S质粒为模板,PCR扩增得到964bp的编码TGEV S蛋白A和D抗原位点的基因片段,并推导出321aa氨基酸序列,构建了克隆载体pMD19T-S1。根据Genbank上的猪源ETEC的LTB序列（M17873）,设计并合成一对特异性引物,PCR扩增得到395bp的基因片段,并推导出131aa氨基酸序列,构建了克隆载体pMD19T-LTB。用DNAstar软件将测序结果中LTB的ORF与GenBank中收录的猪源ETEC菌的LTB基因参考序列（M17873）相比较,其核苷酸同源性为100%。2.减毒沙门氏菌表达TGEV S蛋白疫苗株的构建首先将LTB基因通过EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点转移到pVAX载体上,然后再将S1基因通过BamHⅠ和HindⅢ插入pVAX-LTB中,接着利用EcoRⅠ和HindⅢ将pVAX-LTB-S1质粒中的LTB-S1片段转入pYA3342质粒,最终得到沙门氏菌表达载体pYA3342-LTB-S1。同时,利用BamHⅠ和HindⅢ酶切位点将S1基因通过插入pYA3342质粒中,得到重组质粒pYA3342-S1。将pYA3342-S1和pYA3342-LTB-S1分别依次电转化X3730和X4550沙门氏菌,得到减毒沙门氏菌X4550（pYA3342-S1）和X4550（pYA3342-LTB-S1）;用SDS-PAGE分析在终浓度为1mmol/L IPTG的诱导下减毒沙门氏菌表达产物,结果表明S基因及与LTB融合基因在减毒沙门氏菌表达系统中都获得表达,表达的重组蛋白分别约为37kDa和49kDa。3.重组疫苗株的生物学特性初步研究本实验构建的2株重组菌生长特性方面与X4550（pYA3342）相比没有显著变化;同时在LB（DAP+）液体培养基中连续传10代后,含重组质粒的菌株达到98%以上。1×1010或1×1011CFU重组菌X4550（pYA3342-LTB-S1）和X4550（pYA3342-S1）分别灌胃接种6～8周龄昆明小鼠,用PCR方法检测其肝脏和脾脏中的重组菌,结果接种后第3天都可在肝脏和脾脏中检测出两种重组减毒沙门氏菌,连续检出3周;连续观察30天,小鼠无异常症状。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 文献综述
• 1.猪传染性胃肠炎病毒分子生物学特征及猪传染性胃肠炎疫苗的研究进展
• 1.1 TGEV病原学特征
• 1.2 病毒生物学特征
• 1.3 病原分子生物学
• 1.4 TGEV疫苗研究情况
• 2 以减毒沙门氏菌作为疫苗活载体的研究
• 2.1 沙门氏菌的减毒方法和机制
• 2.2 减毒沙门氏菌进入机体免疫系统的可能机制
• 2.3 以减毒沙门氏菌为载体传递外源抗原的研究
• 本研究目的和意义
• 材料与方法
• 1.材料
• 1.1 主要试剂及配置方法
• 1.2 生物材料
• 1.3 主要设备
• 2.方法
• 2.1 TGEV S1基因片段的PCR扩增及T-A克隆
• 2.2 LTB基因的PCR扩增及T-A克隆
• 2.3 S1基因及与LTB双基因融合在沙门氏菌表达的重组质粒构建
• 2.4 重组质粒电转化减毒沙门氏菌
• 2.5 重组菌X1和X2的生长特性试验
• 2.6 重组菌的体外稳定性试验
• 2.7 重组菌的安全性实验
• 3.结果
• 3.1 S1基因的亚克隆及序列分析
• 3.2 LTB基因的克隆及序列分析
• 3.3 含重组质粒的减毒沙门氏菌X4550的构建及鉴定结果
• 分析与讨论
• 1.目的基因的选择
• 2.减毒鼠伤寒沙门菌作为载体及asd平衡致死系统的特点
• 3.肠毒素大肠杆菌热敏性肠毒素B亚单位作为黏膜免疫佐剂
• 4.双基因融合原核表达载体的构建
• 5.目的蛋白的表达
• 6.关于重组菌的生物学特性的初步研究
• 结论
• 主要参考文献
• 致谢
• 附图
• 附录