论文摘要
大鼠是生命科学研究中常用的实验动物之一，大鼠体外受精技术的发展不仅有利于大鼠种质资源保存，而且还可推动受精分子机制、胚胎发育及生殖毒理等生殖生物学领域的深入研究，具有重要的实用价值和理论意义。本试验主要以SD大鼠为研究对象，对其超数排卵、体外受精、胚胎体外培养及胚胎移植等技术进行探讨，实验内容和结果如下：1．观察了不同剂量水平的PMSG/hCG对幼龄大鼠的超数排卵效果。结果表明，4～5周龄组SD大鼠在激素剂量为20 IU/只时，平均超排采卵54.6枚，明显高于其他剂量组；6～7周龄组在激素剂量为40 IU/只时超排采卵数最多，为32.7枚，但与30 IU和50 IU剂量组差异不明显；8～9周龄组超排效果最差，用不同剂量超排最高平均采卵21.5枚。本试验表明，SD大鼠的超排效果随着年龄增长而下降，4～5周龄雌鼠超排效果最好，其中激素剂量为20 IU/只时超排采卵数最多。2．采用阴道涂片检查的方法对大鼠发情周期的不同阶段进行观察，分析各个发情周期阴道上皮细胞的变化情况。结果发现，发情周期的不同阶段，阴道上皮细胞类型呈规律性变化：发情前期的阴道涂片以椭圆形的有核上皮细胞占绝大多数；发情期的阴道涂片以片状的，角质化上皮细胞占绝大多数；发情后期的阴道涂片，片状角质化上皮细胞、有核上皮细胞和白细胞同时存在，且比例相当；发情间期的阴道涂片以白细胞占绝大多数。3．对大鼠进行胚胎移植研究，比较了自然排卵和超数排卵所得卵子的质量差异。结果显示，经超排处理的2-细胞胚胎在移植给受体后，妊娠率为63.3％，自然排卵组的妊娠率为60％，统计学差异不显著。4．选用mKRB、IVF30和mR1ECM-BSA作为精子获能液和体外受精液，对SD大鼠进行体外受精。结果表明，用IVF30培养液对SD大鼠进行IVF可以获得73.8％的2-细胞卵裂率，显著高于mR1ECM-BSA组和mKRB组（分别为13.5％和21.1％）。5．选定IVF30为精子获能液和体外受精液，对影响体外受精的一些关键因素如精子获能时间，注射hCG后收集卵子的时间，以及精子与卵子的共孵育时间进行研究。结果发现，在IVF30培养液中，大鼠精子不经获能也可以使卵子受精（受精率为33.8％），但受精率在一定范围内随着获能时间的延长呈上升趋势，在获能7 h时受精率最高，为83.2％，明显高于其他各组，继续获能9 h后再与卵子相遇则受精率下降；注射hCG后13 h收集卵子进行体外受精，受精率最高，为88.6％，继续推迟采卵时间，则受精率下降；精卵相互作用6、9、12 h后的2-细胞卵裂分别为70.9％、78.6％和73.8％，统计学差异不显著；6．主要研究了BSA、PVA及葡萄糖浓度对大鼠胚胎体外发育的影响。结果发现，BSA和PVA对受精卵至4-细胞期前的发育差异不显著，但PVA的添加似乎更支持4-细胞期以后的胚胎发育，21.4％的胚胎能够发育到囊胚，而BSA组则没有胚胎发育到囊胚：不同浓度葡萄糖对大鼠受精卵体外培养的结果显示，0.2 mM组的囊胚发育率为仅为4.1％，显著低于5.5 mM组和7.5 mM组（23.5％和21.4％），而5.5 mM组和7.5mM组的囊胚发育率不显著。7．用IVF30对更多品系大鼠进行体外受精试验，并对体外受精所得2-细胞胚胎进行了体内移植。结果表明，IVF30不仅适合用作SD大鼠的精子获能和体外受精液，在Wistar、GK和F344大鼠也可以获得比较高的体外受精率（分别为72.6％、87.8％和71.6），GK大鼠的体外受精率甚至高于SD大鼠（为83.2％），但四个品系的体外受精率差异均不显著；胚胎移植的结果显示，IVF所得2-细胞移植后能够妊娠并产仔，产仔率为12.5％，但明显低于对照组（60％）。