玉郎伞黄酮对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究

玉郎伞黄酮对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究

论文摘要

心肌持续一段时间缺血后重新恢复血液灌注,损伤的心肌结构和功能不仅不能恢复,反而会加重的现象称为心肌缺血再灌注损伤(myocardialischemia reperfusion injury,MIRI)。近年来,MIRI成为研究的热点。我国中药资源极为丰富,从中寻找防治MIRI的安全有效药物,特别是对其活性成分进行药效学及作用机制的研究,对于开发我国丰富的中药资源和促进中药现代化具有重要意义。广西有丰富的中草药资源,玉郎伞(Yulangsan,YLS)是广西民间应用的壮药。研究发现玉郎伞提取物具有减轻MIRI的作用。玉郎伞的活性成分玉郎伞黄酮(Yulangsan flavonoids,YF)是否具有抗MIRI作用,未见报道。本课题拟在整体、细胞、分子基因水平研究YF对MIRI的保护作用及其机制,为开发广西特色民间药材玉郎伞活性成分治疗冠心病提供理论和实验依据。目的:1.研究YF对正常大鼠心脏血流动力学的影响:观察YF对心率(HR)、左心室收缩压(LVSP)、左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)的影响及作用显效时间。2.研究YF对大鼠MIRI的保护作用及其机制:观察YF对MIRI大鼠左心室血流动力学、心肌组织病理结构及细胞超微结构的影响、脂质过氧化损伤、心肌梗死面积、一氧化氮合酶、心肌组织ANT 1及Caspase 3基因表达、心肌组织Bcl-2和Bax蛋白表达的影响。3.利用乳鼠心肌细胞缺氧复氧模型来研究YF抗MIRI的机制。方法:1.研究YF对正常大鼠心脏血流动力学的影响:选取心电图正常的SD大鼠,随机分为3组,每组10只,雌雄各半:空白对照组、生理盐水组和YF组,经颈总动脉行左心室内插管,MS4000生物信号定量记录分析系统记录给药前后心率(HR)、左心室收缩压(LVSP)、左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)。2.研究YF对大鼠MIRI的保护作用及其机制:选取心电图正常SD大鼠,随机分为7组,每组10只,雌雄各半:假手术(SHAM)组、心肌缺血再灌注损伤(MIRI)组、生理盐水(NS)组、YF低剂量(YFL)组、YF中剂量(YFM)组、YF高剂量(YFH)组、阳性药物(DIL)组。缺血前30min经十二指肠注射给药。结扎大鼠冠状动脉左前降支30min后,再灌注60min,建立MIRI模型。再灌注60min后,测定下列各项指标:2.1利用MS4000生物信号定量记录分析系统记录HR、LVSP、+dp/dtmax、左心室内压最大下降速率(-dp/dtmax)、左心室舒张压(LVDP)、左心室舒张末期压力(LVDEP)、左室开始收缩至+dp/dtmax的间隔时间(t-dp/dtmax)。2.2取大鼠缺血区的心肌组织,常规制作组织切片、电镜切片,光镜、电镜下观察心肌组织病理结构、超微结构的变化并拍照。2.3从腹主动脉采血2ml,离心,取上层血浆,按试剂盒说明测定AST、CK、CK-MB、LDH、LDH1,SOD、GSH-Px的活性、MDA含量。2.4从腹主动脉采2ml,离心,取上层血浆,按试剂盒说明,测定一氧化氮合酶(NOS)活性,TTC法测量心肌梗死面积。2.5取缺血区心肌组织提取RNA,RT-PCR法检测ANT1、Caspase 3的mRNA表达。2.6取缺血区心肌组织,免疫组化法测定Bcl-2和Bax蛋白表达。3.建立乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤模型研究YF抗MIRI的机制:培养原代心肌细胞,实验选取搏动良好的细胞,随机分为7组:①正常对照(Control)组,②阳性药维拉帕米(verapamil)组,③YF高剂量(YFH)含药血清组,④YF中剂量(YFM)含药血清组,⑤YF低剂量(YFL)含药血清组,⑥空白血清(Blank)组,⑦缺氧复氧(H/R)损伤模型(Model)组。除对照组外,均建立心肌细胞H/R损伤模型;向心电图正常的SD大鼠十二指肠注射YF及NS制备YF含药血清及空白血清;MTT法观测H/R心肌细胞活力、按试剂盒说明测定心肌细胞H/R前、后培养液中LDH、NOS的活性、H/R心肌细胞中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性、吖啶橙染色观察H/R心肌细胞凋亡的形态变化、Annexin V-FITC/PI双染法检测心肌细胞凋亡率。结果:1.YF对正常大鼠心脏血流动力学的影响:与生理盐水组比较,YF组在给药后40min、50min、60min时HR、LVSP和+dp/dtmax明显降低(P<0.05)。2.YF对大鼠MIRI的保护作用及其机制:2.1与MIRI组相比,再灌注60min(r60min)时,YFH、YFM、DIL组的HR、LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax高于MIRI组(P<0.05),YFH、YFM、DIL组的LVDP、LVDEP、t-dp/dtmax低于MIRI组(P<0.05)。2.2光镜下观察,MIRI组心肌纤维排列紊乱、肿胀、部分断裂,甚至出现片状坏死,周围有炎性细胞浸润,红细胞漏出明显。YFH、YFM、DIL组的损伤明显减轻。电镜下观察,MIRI组的心肌细胞的肌丝、线粒体、闰盘等破坏明显,而YFH、YFM、DIL组则明显减轻。2.3与MIRI组比较,YFH、YFM组血浆各心肌酶活性、MDA含量明显低于MIRI组(P<0.01),YFH、YFM组的SOD、GSH-Px活性明显高于MIRI组(P<0.01)。2.4与MIRI组比较,YFH、YFM组的心肌梗死面积明显低于MIRI组(P<0.01或P<0.05),YFH、YFM组的tNOS、cNOS活性明显增高(P<0.01),iNOS活性明显降低(P<0.01)。2.5与MIRI组比较,YFH组的ANT1mRNA表达上调(P<0.05),Caspase3的mRNA表达下调(P<0.05)。2.6与MIRI组相比,各组的Bcl-2蛋白表达无差异(P>0.05),Bax蛋白表达及Bax/Bcl-2的比值在YFH、YFM组的表达明显降低(P<0.05)。3.YF含药血清对乳鼠心肌细胞缺氧复氧性损伤的影响:与模型组比较,YFH、YFM组的H/R后心肌细胞活力高于模型组组(P<0.05);H/R前,培养液中LDH、tNOS、iNOS、cNOS的活性各组间无显著性差异(P>0.05);H/R后,与模型组比较,YFH、YFM组的LDH、iNOS明显降低(P<0.05),tNOS、cNOS的活性明显增高(P<0.05);YFH、YFM组的心肌细胞的Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明显增高(P<0.05);吖啶橙染色后,YFH、YFM组的细胞胞浆呈红色荧光,细胞核呈均匀绿色,细胞密度较Control组的低,但明显高于模型组;流式细胞仪检测显示,YFH、YFM、YFL组的心肌细胞死亡率和凋亡率明显低于模型组。结论:1.YF是YLS负性心率作用及负性肌力作用的活性成分之一,YF在给药后50min左右时作用最明显。2.YF对MIRI大鼠的心肌功能与结构均有明显的保护作用,并呈一定的量效关系。其机制可能与YF的负性心率、负性肌力作用、抗氧化应激损伤、提高cNOS的活性、降低iNOS的活性、上调ANT1mRNA的表达、保护Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性以及通过下调Caspase3 mRNA的表达、Bax蛋白的表达和Bax/Bcl-2比值而抑制心肌细胞凋亡有关。

论文目录

  • 主要英文缩略词表
  • 中文摘要
  • ABSTRACT
  • 前言
  • 参考文献
  • 第一部分 玉郎伞黄酮对正常大鼠心脏血流动力学的影响
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • 讨论
  • 参考文献
  • 第二部分 玉郎伞黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响
  • 实验一 YLS黄酮对心肌缺血再灌注大鼠心脏血流动力学的影响
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • 讨论
  • 参考文献
  • 实验二 YLS黄酮对心肌缺血再灌注大鼠心肌组织形态学的影响
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • 讨论
  • 参考文献
  • 实验三 YLS黄酮对心肌缺血再灌注大鼠脂质过氧化损伤的影响
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • 讨论
  • 参考文献
  • 实验四 YLS黄酮对心肌缺血再灌注大鼠心肌梗死面积及一氧化氮合酶的影响
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • 讨论
  • 参考文献
  • 实验五 YLS黄酮对心肌缺血再灌注大鼠心肌组织ANT1及Caspase-3基因表达的影响
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • 讨论
  • 附录:引物、各目的基因的mRNA序列及RT-PCR产物测序分析结果
  • 参考文献
  • 实验六 YLS黄酮对心肌缺血再灌注大鼠心肌组织Bcl-2和Bax蛋白表达的影响
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • 讨论
  • 参考文献
  • 第三部分 玉郎伞黄酮含药血清对乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的影响
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • 讨论
  • 参考文献
  • 全文总结
  • 创新点及意义
  • 综述一:心肌缺血再灌注损伤的机制研究现状
  • 1 氧自由基与MIRI
  • 2+超载与MIRI'>2 Ca2+超载与MIRI
  • 3 能量代谢障碍与MIRI
  • 4 炎症损伤与MIRI
  • 5 NO/NOS与MIRI
  • 6 细胞凋亡与MIRI
  • 7 细胞信号转导与MIRI
  • 8 其他因素与MIRI
  • 参考文献
  • 综述二:黄酮类化合物抗心肌缺血再灌注损伤的研究现状
  • 1 黄酮类化合物的定义及其功能结构
  • 2 黄酮类化合物的分类
  • 3 与抗MIRI有关的药理作用
  • 4 抗MIRI的中药黄酮类化合物
  • 参考文献
  • 致谢
  • 读博士期间的工作成果
  • 相关论文文献

    标签:;  ;  ;  ;  ;  ;  ;  

    玉郎伞黄酮对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究
    下载Doc文档

    猜你喜欢