猪肺炎支原体MY-99株P46基因的克隆测序及原核表达

论文摘要

猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneuminiae,Mhp）是猪支原体肺炎的病原体。P46基因是编码猪肺炎支原体膜蛋白P46的基因片段,P46膜蛋白被认为是Mhp的特异性表面蛋白。本研究根据已报道的序列,设计了一对带有BAMHI和HINDⅢ酶切位点的引物,利用PCR从Mhp野毒株MY-99扩增出了P46基因,经克隆测序,该基因序列全长1134bp,编码378个氨基酸,预计其表达的蛋白分子量为41.49KDa,PI值为5.97。该基因序列中含有3个TGA编码Trp,将MY-99株的P46基因与Mhp国际标准株232株、J株和7446株比较其的同源性达到99%,且其编码氨基酸的同源性也达99%以上。P46基因经过克隆,通过设计的引物进行定点突变,利用引物分别针对3个位点的TGA进行修饰,通过测序验证,我们成功地对MY-99株的基因进行了改造,将182、381和734位的A突变G,并将T载体内的P46基因亚克隆嵌入表达载体pet-32a（+）,构建了pet-32a（+）-P46重组质粒。将重组质粒转化进表达菌rosetta,得到重组表达菌Ro-CTB600。在IPTG的诱导下,P46蛋白在重组表达菌中获得了融合表达,得到了融合蛋白Trx-P46。通过SDS-PAGE分离纯化表达的融合蛋白Trx-P46产物检测证实,重组表达的Mhp-MY-99株的P46为融合蛋白,其大小与预测的分子量相同为61.79KDa（其重组质粒中由TrxA及其它附加序列编码蛋白的分子量约为20.3 KDa,表达的P46蛋白约为41 KDa）。采用Western-Blotting法,用抗猪肺炎支原体的阳性血清对其表达的融合蛋白进行检测,发现该重组的Trx-P46融合蛋白能与抗Mhp阳性血清发生反应,结果表明P46蛋白已表达。本研究经PCR扩增、克隆和表达,最终获得了Mhp的融合蛋白Trx-P46,为Mhp的实验室检测和基因工程疫苗的研制奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 前言
• 1.1 猪肺炎支原体病原学
• 1.2 猪肺炎支原体的致病性
• 1.3 Mhp的膜蛋白研究
• 1.4 猪肺炎支原体P46的研究背景
• 1.5 研究目的
• 2. 试验材料
• 2.1 菌株、质粒和细胞
• 2.2 主要试剂及仪器
• 2.2.1 试剂、培养基及溶液
• 2.2.2 仪器
• 2.3 主要生物信息数据库和计算机软件
• 3. 试验方法
• 3.1 猪肺炎支原体的培养
• 3.2 PCR
• 3.2.1 引物设计
• 3.2.2 PCR模板的制备
• 3.2.3 PCR反应
• 3.2.4 PCR扩增产物的电泳检查
• 3.2.5 PCR产物回收纯化（按照试剂盒使用说明操作）
• 3.3 P46基因的定点突变
• 3.3.1 T载体的克隆
• 3.3.2 P46基因的定点突变
• 3.4 P46基因的原核表达
• 3.4.1 原核表达
• 3.4.2 SDS-PAGE和WESTERN-BLOTTING
• 4. 结果与分析
• 4.1 P46基因的PCR扩增
• 4.2 序列测定及同源性比对
• 4.3 定点突变
• 4.3.1 T载体克隆
• 4.3.2 克隆P46基因的序列测定及推导氨基酸序列
• 4.3.3 定点突变结果
• 4.3.4 亚克隆实验结果
• 4.4 SDS-PAGE和Western-blotting实验
• 5. 实验结果分析讨论
• 5.1 猪肺炎支原体MY-99株P46基因的PCR扩增及序列分析
• 5.2 定点突变结果分析
• 5.3 P46的原核表达
• 6. 结论
• 主要参考文献
• 致谢
• 附录