论文摘要
经皮冠状动脉腔内成形术（PTCA）已经成为冠心病患者的主要治疗手段之一，然而PTCA术后的高再狭窄（RS）率，严重影响了心脏介入治疗的远期疗效。RS形成的病理机制还不十分清楚，有充足的证据表明，血管内皮细胞（VEC）、血管平滑肌细胞（VSMC）、血管外膜成纤维细胞（VAF）、其他血管壁细胞和细胞外基质（ECM）均参与了RS的形成。传统认为血管外膜仅仅起支持和营养作用的观点受到质疑，它也积极参与了血管损伤后的一系列应激反应。近年来提出的血管重塑（VR）学说，认为不利的VR可能是引起RS的重要原因，VAF在血管损伤情况下迅速增殖、活化、分泌胶原参与血管的生理或病理性修复过程。VAF的一系列变化促进血管外膜纤维化，像收缩的瘢痕一样，缩窄受损的血管，导致管腔狭窄，参与再狭窄的形成。中医药在心血管疾病防治方面有着悠久历史和独特优势，临床研究表明活血化瘀类方药对防治PTCA术后RS形成具有良好的疗效。中药作用机制复杂，具有多途径多靶点整合作用的特点，研究发现活血化瘀类中药通过多方面机制发挥效应，包括：抑制血小板活化，抗血栓形成，拮抗钙离子，抑制血管紧张素转化酶活性，抑制VSMC增殖及抑制炎症反应等。VAF的特性及其在RS过程中发生的生物学行为改变使其成为RS防治的潜在靶点。本实验以此为着眼点，对VAF在血管损伤中的刺激因素作用下的变化进行观察，选取4种具有代表性的活血化瘀中药进行研究，观察其主要成分对前述病理过程的干预或逆转作用。为更深入揭示中药作用机理做一些有益尝试，提供实验依据。本实验探讨了4种经临床证实药效明确的活血化瘀中药川芎、葛根、丹参、丹皮的主要成份盐酸川芎嗪（tetramethylpyrazine），葛根素（puerarin），丹参酮ⅡA（tanshinoneⅡA），丹皮酚（paeonol）对血管紧张素Ⅱ（ANGⅡ）诱导的VAF增殖及胶原蛋白表达的影响。主要研究内容分为如下三部分：一大鼠血管外膜成纤维细胞原代培养、鉴定及生物学行为研究本实验采用组织块贴壁法，建立了大鼠胸主动脉VAF的原代培养方法。采用免疫细胞化学染色法对细胞进行鉴定，并进行了细胞的形态学观察和生物学特性研究，采用MTT法测定细胞活力，间接反映细胞生长状况。结果发现组织块干涸贴壁，高营养培养基（含20％胎牛血清的DMEM培养基）进行诱导，有利于细胞迅速萌出，0．25％胰酶消化细胞进行传代，常规培养基（含10％胎牛血清的DMEM培养基）维持培养，细胞可迅速增殖，成典型的放射状排列走行，在第2-4d进入指数生长期。这样培养的VAF性状稳定，生长状态良好，纯度高，可传至7-8代。中间丝蛋白是细胞骨架蛋白的一种，具有组织特异性，常用来鉴别细胞的组织来源。采用间质性来源的波形蛋白（Vimentin），肌性来源的结蛋白（desmin）和内皮性来源的第Ⅷ因子（vWF）进行细胞的免疫化学染色，结果发现Vimentin染色阳性，鉴定细胞为间质组织来源，而desmin和vWF染色阴性，排除了其肌源性细胞和内皮来源细胞的可能。本方法简便，实验周期短，可操作性强，为相关血管性疾病的体外研究创造了条件。二盐酸川芎嗪、葛根素、丹参酮ⅡA、丹皮酚对正常及ANGⅡ诱导的VAF增殖的影响本实验目的是摸索盐酸川芎嗪、葛根素、丹参酮ⅡA、丹皮酚的最大无毒剂量，并观察它们在无毒剂量范围内对正常VAF增殖的影响，在此基础上以ANGⅡ为刺激因素，模拟血管损伤时对VAF的影响，进一步研究这些中药单体成分对病理状态下细胞异常增殖的影响。实验取第3代原代培养的VAF，以不同浓度梯度的4种中药单体成分作用于细胞，MTT法测定细胞的活性，并观察细胞的形态变化。结果发现盐酸川芎嗪在4．0×10-3mol·L-1，葛根素在2．0×10-3mol·L-1，丹参酮ⅡA在2．0×10-5mol·L-1，丹皮酚在4．0×10-3mol·L-1时对细胞无明显毒性作用，与正常对照组比较无统计学意义（P>0．05），因此确定它们为最高给药浓度。选取以下浓度：盐酸川芎嗪：2．0×10-5，1．0×10-4，5．0×10-4，2．0×10-3，4．0×10-3mol·L-1；葛根素：5．0×10-6，2．0×10-5，1．0×10-4，5．0×10-4，2．0×10-3mol·L-1；丹参酮ⅡA：1．0×10-7，4．0×10-7，2．0×10-6，1．0×10-5，2．0×10-5mol·L-1；丹皮酚：2．0×10-5，1．0×10-4，5．0×10-4，2．0×10-3，4．0×10-3mol·L-1作用于细胞，采用MTT法测定细胞的活性，连续观察5d，进行药物对正常细胞增殖作用的考察，做时效、量效曲线。结果发现这4种单体成分对正常VAF的增殖随时间延长逐渐表现出一定的抑制增殖作用（P<0．05或P<0．01），但在短期内无明显作用（P>0．05），除葛根素外，其他各成分的抑制作用均显示出一定的量效关系。采用ANGⅡ作为刺激因素，证实其具有刺激VAF增殖的作用，并对ANGⅡ的最佳刺激浓度进行了摸索，MTT法测定细胞增殖活力，结果发现以1×10-7mol·L-1ANGⅡ刺激24h后细胞增殖效应最明显，与正常细胞对照组比较呈现显著差异（P<0．01），因此采用1×10-7mol·L-1为造模浓度。在上述实验基础上，观察川芎嗪等4种成分对ANGⅡ诱导的VAF增殖的作用，结果发现4种单体成分作用于细胞24h后，均能显著抑制ANGⅡ诱导的细胞异常增殖，与模型组比较差异显著（P<0．05或P<0．01），并且呈现良好的量效关系。本实验说明这4种活血化瘀中药单体成分对正常VAF增殖的作用缓慢而温和，对刺激因素作用下的VAF的异常增殖具有迅速、显著的抑制作用，推测这些单体成分抑制病理性VAF增殖是其抑制血管再狭窄的作用机制之一。三盐酸川芎嗪、葛根素、丹参酮ⅡA、丹皮酚对ANGⅡ诱导的VAF胶原蛋白表达的影响合成胶原蛋白是VAF的特性，在某些刺激因素作用下，细胞表达胶原蛋白增多。本实验以ANGⅡ为刺激因素，观察川芎嗪等4种成分对ANGⅡ诱导的VAF胶原蛋白表达的影响。原代培养的第3代VAF用1×10-7mol·L-1ANGⅡ予以刺激，分别加入如下浓度的4种单体成分：盐酸川芎嗪：2．0×10-5，1．0×10-4，5．0×10-4，2．0×10-3，4．0×10-3mol·L-1；葛根素：5．0×10-6，2．0×10-5，1．0×10-4，5．0×10-4，2．0×10-3mol·L-1；丹参酮ⅡA：1．0×10-7，4．0×10-7，2．0×10-6，1．0×10-5，2．0×10-5mol·L-1；丹皮酚：2．0×10-5，1．0×10-4，5．0×10-4，2．0×10-3，4．0×10-3mol·L-1，与ANGⅡ共同作用于细胞48h，测定细胞培养液中羟脯氨酸含量来间接反映VAF分泌的胶原含量。结果显示：ANGⅡ在1×10-7mol·L-1时，能明显刺激VAF分泌胶原，与正常细胞对照组比较有显著差异（P<0．01）。这些单体成分对ANGⅡ诱导的VAF分泌胶原增多有显著的抑制作用，与模型组比较有显著差异（P<0．05或P<0．01），并呈现良好的量效关系。在上述实验基础上，采用蛋白免疫印迹法（Western Blotting）检测ANGⅡ刺激下的VAFⅠ型胶原蛋白的前体procollagenⅠ的表达。实验采用1×10-7mol·L-1作为ANGⅡ刺激浓度，以四种成分的最大无毒浓度：盐酸川芎嗪：4．0×10-3mol·L-1；葛根素：2．0×10-3mol·L-1；丹参酮ⅡA：2．0×10-5mol·L-1；丹皮酚：4．0×10-3mol·L-1，与ANGⅡ共同作用于细胞48h，结果显示ANGⅡ能明显刺激procollagenⅠ的表达，与正常对照组比较差异显著（P<0．01），而4种单体成分均能抑制ANGⅡ的这种作用，与模型组比较差异显著（P<0．01），以丹参酮ⅡA抑制作用最明显。本实验首先探讨了川芎嗪等4种中药单体成分对VAF分泌胶原的影响，发现它们抑制VAF胶原分泌呈现良好的量效关系，进一步实验表明它们对Ⅰ型胶原蛋白表达有抑制作用，推测其抑制VAF胶原蛋白合成以抑制Ⅰ型胶原蛋白为主。这一研究结果对我们进一步探讨活血化瘀中药抗RS机理提供了重要线索。上述实验结果表明盐酸川芎嗪、葛根素、丹参酮ⅡA、丹皮酚对正常生长的VAF仅有轻微的抑制作用，却能显著降低ANGⅡ诱导的VAF的异常增殖及胶原蛋白表达增多，这可能是其发挥抗血管损伤后再狭窄及纤维化作用的机制之一，为活血化瘀中药作用机制的进一步研究提供了实验依据。
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