播娘蒿DsCOR蛋白的特性及其在拟南芥缺陷株中的功能鉴定研究

论文摘要

温度是影响植物生存和生长发育的基本环境因子之一，是严重限制植物分布区域及影响作物产量的重要因素。低温寒害是一种危害农业生产的全球性自然灾害，几乎涉及所有的经济植物。每年因低温寒害给农业生产造成的巨大损失数以亿计。因此，研究植物抗寒的分子机制，用基因工程的手段对植物进行改造，进而提高植物的抗寒性，不但具有重大的理论意义，而且对农业生产也具有重要的实际意义。自从1970年Weiser“植物抗寒性诱导过程是基因表达的改变”观点提出以后，植物抗寒研究上升到了分子水平，越来越多的抗寒相关基因被发现。COR（cold-regulated gene）基因是在上世纪90年代初发现的一类受寒冷调控的基因。COR基因是一种诱发基因，只有在特定条件（主要是低温，干旱、高渗也有一定影响）下才得以启动和表达，进而使细胞表现出抗寒力。目前研究的最多的就是拟南芥（Arabidopsis thaliana）中的抗寒基因COR15a。播娘蒿（Bescurania sophia（L．）Webb缩写为Ds）和拟南芥同属十字花科，但播娘蒿的抗寒性较拟南芥强得多。播娘蒿具有极强的适应恶劣环境的能力，在川西高原海拔4000米的地区也生长良好，在西北干旱、盐碱地区，播娘蒿也成为优势群类。播娘蒿极其耐寒，在春天低于0℃的条件下亦能抽苔开花，植株甚至还可以忍受冬天-40℃的低温。可是目前对播娘蒿抗寒机制方面的研究几乎为空白，为了早日开发利用这一宝贵资源，为其它作物的抗冻保护提供依据，我们对播娘蒿抗寒基因进行的系统研究是十分有意义的。本实验室已经对播娘蒿进行了一系列的生理研究，证明播娘蒿较拟南芥的确具有更强的抗寒性；本实验室从播娘蒿中克隆得到抗寒相关基因DsCOR的cDNA序列，并且对其进行了详细的生物信息学分析，发现它与拟南芥COR15a基因具有很高的同源性，蛋白序列也具有很高的相似性。系统发育分析推测播娘蒿DsCOR基因和拟南芥、油菜、苜蓿的抗寒基因属于同源基因。本论文在以上研究的基础之上，对播娘蒿DsCOR基因的转录规律和DsCOR蛋白的特性进行研究，并在拟南芥COR15a缺陷株中对DsCOR基因进行了功能鉴。本文取得的主要结论如下：一、播娘蒿DsCOR基因的转录受低温诱导。本文利用半定量RT-PCR技术，以18S核糖体RNA基因作为内标，研究了低温胁迫对DsCOR基因表达的影响，对实验结果进行分析并得到以下结论：（1）播娘蒿DsCOR基因转录受低温胁迫诱导。常温下该基因不表达，当植物受到低温刺激时，可以在10min中内检测到该基因的mRNA转录产物出现，随着低温胁迫时间的延长，该基因的转录产物逐渐积累达到最大量，并一直保持较高水平。（2）当植物受到低温胁迫时，DsCOR基因的转录产物mRNA可以在短时间内迅速积累，但当温度恢复正常以后，mRNA转录产物在半小时内发生降解。（3）诱导播娘蒿DsCOR基因开始转录的临界温度为8℃。二、播娘蒿DsCOR基因在大肠杆菌系统中实现了高效表达，并纯化得到DsCOR融合蛋白。本文选择成熟、经典的大肠杆菌系统进行DsCOR基因的原核表达，包括：（1）选用pET32a作为原核表达载体，成功构建pET32a-DsCOR原核表达载体，然后将重组质粒转化到表达菌E．coli BL21中。（2）对融合蛋白的可溶性表达条件进行了优化，经过1mM IPTG（终浓度）37℃诱导表达3h后，SDS-PAGE电泳检测表明可溶性的DsCOR蛋白得到大量表达，蛋白大小为31kD，与预期值相符。（3）根据生物信息学预测DsCOR蛋白具有很强的亲水性，建立起“煮沸-镍离子亲和层析法”纯化DsCOR蛋白的方法体系。（4）通过制备性电泳和透析袋电洗脱法成功纯化出DsCOR重组蛋白，纯化得到的DsCOR蛋白用于后续实验。三、播娘蒿DsCOR蛋白具有很强的生理稳定性。对纯化得到的DsCOR蛋白进行了高温耐受性、pH耐受范围、紫外耐受性几个方面的生理性质研究，结果发现：DsCOR蛋白在100℃沸水浴处理4h后仍然保持很好的溶解状态，并且蛋白浓度与初始浓度相比，没有明显降低；该蛋白耐受的酸碱范围大约为pH 3.0—pH 10.5；该蛋白能耐受紫外照射的最长时间为12h，当紫外照射12h或更长时间时，该蛋白发生分解。播娘蒿DsCOR蛋白的强稳定性对于其发挥抗寒蛋白的功能具有重要意义。四、Western bloting结果表明播娘蒿DsCOR蛋白受低温诱导产生。本文通过背部皮下多点注射的方法免疫兔子，制备得到DsCOR蛋白的多克隆抗体，Western bloting结果发现，播娘蒿DsCOR蛋白在常温下不产生，当植物受到低温刺激时该蛋白才开始产生，这一结果与第一章中DsCOR基因的转录调节规律相符，也与拟南芥抗寒蛋白COR15a的表达规律相一致。五、通过农杆菌介导的花序浸染法，播娘蒿DsCOR基因在拟南芥COR15a基因的缺失突变株中得到遗传转化。转基因植物是鉴定基因功能的有效方法，尤其是拟南芥等模式植物的转化。为了鉴定播娘蒿DsCOR基因的功能，本文特选用拟南芥COR15a基因的缺失突变株（由日本RIKEN生物资源中心提供，RIKEN BioResource Center编号：PST15781）为转基因植物材料，并取得以下结果：（1）在DsCOR基因ORF的5′引物和3′引物中引入构建表达载体所需的BamHI和SacI限制酶位点，通过双酶切和连接，成功构建了可以在植物中高效表达的载体pCAMBIA2301G-DsCOR，并用冻融法将其转入根癌农杆菌EHA105中。（2）采用经典的农杆菌介导的花序浸染法，在农杆菌浸染液中加入0.005％表面活性剂Silwet L-77，分批次进行拟南芥PST15781突变株的转化，并且收获了大量转化种子。六、转DsCOR基因拟南芥的低温耐受性提高到野生水平，从而获得了DsCOR基因具有提高植物抗寒性的直接证据。（1）本文采用卡那霉素抗性培养基筛选的方法，将收获的转化后的种子播于含Km 50mg／L的筛选培养基上进行筛选，共获得68株抗性植株。（2）提取抗性植株的基因组DNA，用PCR的方法对抗性植株进行了分子生物学鉴定，共获得8株PCR阳性苗，初步证明DsCOR基因已转入拟南芥细胞基因组中，PCR阳性率为11.76％。（3）在功能分析中，经4℃低温胁迫处理4d，拟南芥突变株PST15781的叶片出现严重的低温损伤，叶片大面积褐化萎蔫，而DsCOR基因在拟南芥突变株中组成型表达后，转基因拟南芥的低温耐受性恢复到野生（正常）水平。这表明播娘蒿DsCOR基因在提高植物抗寒性方面发挥着重要作用。对播娘蒿抗寒基因DsCOR以及抗冻蛋白DsCOR的研究，对于探索播娘蒿具有强耐寒性的原因、从分子水平深入研究植物抗寒作用机制具有重要的意义。播娘蒿抗寒基因DsCOR将会在利用基因工程手段提高农作物和经济作物的耐寒性方面有广阔的应用前景。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一章 低温胁迫对播娘蒿DsCOR基因表达的影响
• 1.材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物来源
• 1.1.2 菌种
• 1.1.3 实验用试剂盒、工具酶和其它试剂
• 1.1.4 仪器
• 1.1.5 引物合成
• 1.2 方法
• 1.2.1 植株的培养
• 1.2.2 播娘蒿的冷胁迫处理
• 1.2.3 播娘蒿总RNA的提取
• 1.2.4 总RNA质量的检测
• 1.2.5 反转录反应合成cDNA
• 1.2.6 内参基因的选择
• 1.2.7 PCR扩增18S rRNA片段
• 1.2.8 用于半定量RT-PCR的引物的设计
• 1.2.9 引物的验证
• 1.2.10 半定量RT-PCR
• 2.结果
• 2.1 总RNA的提取
• 2.2 18S rRNA的cDNA片段的克隆
• 2.3 引物参数
• 2.4 半定量RT-PCR引物的验证
• 2.5 半定量RT-PCR
• 3.讨论
• 3.1 内标的选择
• 3.2 循环数的确定
• 3.3 低温胁迫对播娘蒿DsCOR基因的影响
• 3.4 总RNA的提取
• 第二章 播娘蒿DsCOR基因的原核表达以及蛋白纯化体系的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 载体
• 1.1.3 酶制剂
• 1.1.4 试剂盒
• 1.1.5 主要试剂及试剂配方
• 1.1.6 仪器
• 1.1.7 引物及测序
• 1.2 方法
• 1.2.1 播娘蒿的总RNA的提取
• 1.2.2 反转录PCR
• 1.2.3 播娘蒿DsCOR基因ORF的克隆
• 1.2.4 TA克隆和测序
• 1.2.5 原核表达载体pET32a-DsCOR的构建
• 2法感受态细胞的制备及转化'>1.2.6 大肠杆菌CaCl₂法感受态细胞的制备及转化
• 1.2.7 重组蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测
• 1.2.8 融合蛋白表达条件的优化
• 1.2.9 煮沸-镍离子亲和层析法纯化蛋白及SDS-PAGE电泳检测
• 1.2.10 透析袋电洗脱法纯化蛋白及SDS-PAGE电泳检测
• 1.2.11 目的蛋白的浓缩或冻干
• 1.2.12 目的蛋白浓度的测定
• 2 结果和分析
• 2.1 播娘蒿总RNA的质量检测
• 2.2 表达载体pET32a—DsCOR的构建的结果
• 2.3 融合蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测
• 2.4 融合蛋白表达条件的优化
• 2.5 煮沸-镍离子亲和层析法纯化蛋白
• 2.6 透析袋电洗脱法纯化蛋白
• 2.7 蛋白浓度的测定
• 2.7.1 BSA标准曲线的建立
• 2.7.2 样品中蛋白质含量的测定
• 3.讨论
• 3.1 播娘蒿DsCOR蛋白的生物信息学分析及蛋白纯化方法的确立
• 3.2 播娘蒿DsCOR表达载体与受体菌的选择
• 3.3 SDS—PAGE蛋白质凝胶电泳
• 3.4 透析袋电洗脱法纯化DsCOR蛋白
• 第三章 播娘蒿DsCOR蛋白生理性质以及表达规律的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 动物
• 1.1.2 试剂及试剂配方
• 1.1.3 材料与仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 播娘蒿DsCOR蛋白生理性质的研究
• 1.2.2 抗原制备
• 1.2.3 多克隆抗体的制备
• 1.2.4 间接ELISA法测定效价
• 1.2.5 播娘蒿叶片蛋白的提取
• 1.2.6 Western bloting
• 2 结果与分析
• 2.1 播娘蒿DsCOR蛋白生理性质的研究
• 2.1.1 播娘蒿DsCOR蛋白高温耐受性测定结果
• 2.1.2 播娘蒿DsCOR蛋白酸碱耐受范围测定结果
• 2.1.3 播娘蒿DsCOR蛋白紫外耐受性测定结果
• 2.2 免疫血清的效价测定
• 2.3 Western bloting结果
• 2.3.1 重组蛋白的Western bloting
• 2.3.2 播娘蒿天然植物蛋白的Western bloting
• 3 讨论
• 3.1 播娘蒿DsCOR蛋白抗体的效价测定
• 3.2 播娘蒿DsCOR蛋白性质分析
• 第四章 播娘蒿DsCOR基因根癌农杆菌表达载体的构建及转化拟南芥
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株和载体
• 1.1.2 酶与试剂盒
• 1.1.3 实验器材
• 1.2 方法
• 1.2.1 植物表达载体pCAMBIA2301G-DsCOR的构建
• 1.2.2 用PCR方法检测连接子
• 1.2.3 农杆菌感受态细胞的制备和转化
• 2 结果与分析
• 2.1 载体pCAMBIA2301G-DsCOR的构建结果
• 2.2 根癌农杆菌的转化
• 3.讨论
• 3.1 植物表达载体的选用
• 3.2 大肠杆菌转化效率的提高
• 第五章 花序浸染法转化拟南芥Cor15a基因缺失突变株以及转基因拟南芥的筛选鉴定与功能分析
• 1.材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 菌株
• 1.1.3 主要试剂及试剂配方
• 1.1.4 试剂盒
• 1.1.5 实验器材
• 1.1.6 引物
• 1.2 方法
• 1.2.1 拟南芥的种植
• 1.2.2 农杆菌浸染液的培养
• 1.2.3 花序浸染法转化拟南芥PST15781
• 1.2.4 用抗性选择标记选择转化子
• 1.2.5 再生植株的移栽
• 1.2.6 植物基因总DNA的提取
• 1.2.7 PCR法检测阳性苗
• 1.2.8 拟南芥的低温胁迫处理
• 2.结果
• 2.1 拟南芥的生长过程以及花序浸染
• 2.2 花序浸染法转化拟南芥
• 2.3 用卡那霉素抗性筛选培养基筛选得到抗性转基因植株
• 2.4 抗性植株的移栽
• 2.5 转基因植株的PCR法检测
• 2.6 转基因拟南芥的表型分析
• 3 讨论
• 3.1 转DsCOR基因拟南芥的功能分析
• 3.2 花序浸染法的优缺点和应用
• 3.3 转基因植物的PCR检测
• 结论
• 致谢
• 综述
• 1、低温对植物造成损伤的机制
• 1.1 "膜脂相变冷害"假说
• 1.2 植物内部结冰
• 1.3 冰冻-融化胁迫引起的膜伤害
• 1.4 低温导致的氧化胁迫
• 1.5 六角形II相脂
• 2、冷驯化可以提高植物的抗寒性
• 3、评价植物抗寒性强弱的指标
• 3.1 酶活力
• 3.2 游离氨基酸水平
• 3.3 可溶性多糖含量
• 3.4 多胺含量
• 3.5 花青素含量
• 3.6 电导率
• 3.7 半致死温度
• 4、蛋白质的变化与植物抗寒性的关系
• 4.1 冷驯化过程中植物内可溶性蛋白含量的变化
• 4.2 植物在冷驯化过程中诱导产生新的特异性蛋白
• 5、受冷诱导的转录促进因子家族-CBF
• 5.1 CBF的发现及其作用机制
• 5.2 CBF4的发现以及CBF在植物抗旱中的作用
• 6、植物冷诱导基因COR（cold-regulated gene）
• 7、播娘蒿抗寒相关研究
• 参考文献