大、小鼠卵泡培养方法及其在雌性生殖毒性研究中的应用

论文摘要

生殖和发育功能障碍是当前严重影响人体健康的主要公共卫生问题之一。外源性化学物作用于雌性生殖系统可以导致卵巢周期紊乱或不育,致使人群中自发性流产率、子代发育异常、生育力下降等显著增加。同时,雌性所有的配子在出生前就已经形成,出生时卵泡的数量是固定的,如果破坏了,无额外的配子补偿,后果较雄性更严重。因此,筛选和鉴定具有雌性生殖毒性的化学物,阐明其毒作用机制,对防治化学物引起的生殖系统危害具有重要意义。近年来由于组合化学、计算机辅助药物设计等的快速发展带来新化学物的快速增长,现有毒理学评价方法已远远不能满足化学物快速增长的需求。因此,国际上的发展趋势是在方法学上要求发展符合“4R”原则（替代、减少、优化和可靠性）、具有高通量、所需受试样品量少的试验方法。目前雌性生殖毒性评价方法主要采用体内试验,存在的主要问题是整体动物实验不敏感、周期长、所需受试样品量多。体内试验难以揭示毒作用位点和毒作用机制。为此,近几年国内外已经建立了多种体外雌性生殖毒性试验方法,包括卵巢器官和卵巢皮质薄片培养方法和大鼠颗粒细胞和黄体细胞体外毒性试验方法。但这些体外方法无法对卵泡发育和卵子生成做出客观评价,而这应是雌性生殖毒性研究的关键所在。因此,迫切需要发展既能快速检测雌性生殖毒性又能更好地研究其作用机制的新方法。卵泡体外培养方法是近年来发展的将早期卵泡不成熟卵母细胞（GV期或GV前期）在体外发育到可正常受精的成熟卵母细胞（MⅡ）的方法。由于该方法能对卵巢的主要功能即卵泡发育、激素生成和卵子发生进行动态观察,可在卵泡不同发育阶段对卵泡每一组分进行分析,因此受到生殖生物学和生殖毒理学界的关注。目前国外已经成功建立或基本建立绵羊、猪、小鼠腔前卵泡体外培养模型,并已应用于生殖生物学和生理学对卵泡发育和调控的研究。已有学者尝试将小鼠模型用于生殖毒性研究,但尚未发展成为毒性试验系统。有关大鼠腔前卵泡体外研究极少,仅见大鼠卵泡体外短期阶段性培养的个别研究,目前国内外尚未见类似小鼠可比较完整地观察大鼠卵泡发育过程和卵子形成的体外培养系统的报道。本研究拟借鉴国外的经验,首先建立小鼠腔前卵泡体外培养方法,在此基础上尝试建立大鼠腔前卵泡的体外培养方法;然后选择已知卵巢毒物探讨大小鼠腔前卵泡体外培养方法用于雌性生殖毒物鉴定和机制研究的可行性,目的是为建立一个既可对雌性生殖毒物进行筛选或鉴定,又可对生殖毒作用机制进行研究的体外毒性试验系统提供依据。一、小鼠腔前卵泡体外培养方法的建立采用机械性方法分离出生后（post-natal day,PND）PND12～14（C5781/6JxCBA/Ca）小鼠卵巢内直径为100～130μm的腔前卵泡,96孔板单个卵泡在石蜡油覆盖的M1培养基内连续培养12d后诱导排卵16h,观察卵泡发育、激素分泌和卵子形成,并将体外卵母细胞的成熟情况与体内卵母细胞的生长情况（in vivo growth and in vitromaturation of oocytes,IVM）进行比较,以判断体外培养方法是否成功。1.小鼠卵泡体外发育特征7只小鼠分离出419个卵泡,机械性分离完整卵泡率为376/419（89.74%）,卵泡和卵母细胞直径分别从118.51±10.40μm和50.75±1.67μm增加到培养d12的452.03±110.25μm和69.54±1.55μm;培养d12卵泡存活率为86.87%（364/419）,有腔形成率为31.03%（130/419）;诱导排卵后COCs排出率为50.60%（212/419）。小鼠卵泡体外发育形态学变化:体外培养的部分卵泡经历从腔前卵泡、有腔卵泡、排卵前卵泡、卵丘细胞—卵母细胞复合体（COCs）排出、卵母细胞成熟和极体排出的形态学变化,也有部分卵泡不发生腔样结构改变,在卵泡中央可见卵丘—卵母细胞复合体,周围颗粒细胞平铺在培养板上,间隙不明显。2.小鼠卵泡体外激素分泌的变化收集d10、d12、d13更换的培养基测定卵泡激素P,每个时间点收集1-3个样品;收集d4、6、8、10、12更换的培养基测定卵泡激素E2。E2和P的检测采用磁性酶联免疫法,E2抗体用17β-oestradiol,质控管在600～900pg/ml;P质控管在7～13ng/ml。体外培养卵泡从d4天开始检测到E2增加,并且随着培养时间延长持续增加,d10～12维持在较高水平;d12诱导排卵刺激后P分泌量急剧增加,体外培养卵泡分泌E2和P激素与体内分泌特征一致。3.小鼠卵母细胞体外成熟研究结果显示,IVG组4.61%（10/217）卵母细胞不能恢复成熟（停止在GV期）,76.50%（166/217）停止减数分裂在GVBD期,18.89%（41/217）卵泡发出PB;而IVM组1.24%（3/241）的卵母细胞不能恢复成熟（停止在GV期）,45.23%（109/241）停止减数分裂在GVBD,53.53%（41/241）卵泡发出PB;能完全成熟过渡到MⅡ期（PB排出）卵母细胞的比例在各个试验组之间有差异;没有一个卵母细胞完全发育成染色体不分离的超倍体。综上可见,从卵泡发育、激素合成和卵母细胞成熟三方面显示本研究建立的小鼠腔前卵泡体外培养方法基本是成功的,与国内上海计生所汪玉宝等报道实验结果基本一致,但本研究卵母细胞PB形成率低于国外Sun F等微滴三维培养结果,有待进一步优化和完善培养体系。二、大鼠腔前卵泡体外培养方法的建立1.大鼠卵泡体外培养条件的确定（1）不同大小卵泡培养效果的比较:分别收集了直径为100～130μm,131～150μm,151～160μm卵泡在体外培养11d,观察卵泡发育情况,结果表明:100～130μm大小的卵泡在培养dll有腔卵泡形成率、卵泡存活率、COCs排出率和成熟阶段卵母细胞明显较131～150μm组和151～160μm组减少,差异有统计学意义（P＜0.05）,而131～150μm组和151～160μm组之间无显著性差异。因此选择直径为131～150μm大小的腔前卵泡进行体外培养比较合适。（2）不同鼠龄分离出的不同大小卵泡比例的差异:采用机械性分离不同大鼠鼠龄的卵泡,直径为130～150μm卵泡在不同鼠龄中所占比重存在差异:PND13所占比例最大,约94.87%,PND12和PND14分别为17.54%和小于29.58%。（3）诱导起始排卵时间的选择:分别于d10、d11、d12诱导卵泡排卵后观察COCs的排出,结果显示这三个时间点COCs的排出率无显著性差异（P＞0.05）,因此d10、d11、d12都可以作为诱导卵泡排卵的时间。（4）COCs排出观察时间的确定:大鼠卵泡在培养d11诱导排卵刺激16～22h观察COCs的排出情况,结果显示COCs排出率随着时间延长而增加,诱导刺激后20hCOCs排出率最高,达47.84%,因此选择大鼠卵泡COCs排出的观察时间为20h。（5）每组卵泡数的确定:鉴于各观察指标的变异情况与小鼠卵泡培养的结果近似,故参照国外Val’erie Van Merris等报告结果,确定每组卵泡样本数为16～20个。2.大鼠卵泡体外发育特征4只PND13 SD大鼠共分离出296个腔前卵泡。机械性分离完整卵泡率为96.28%（285/296）,卵泡和卵母细胞直径分别从141.26±8.82μm和51.25±1.37μm增加到培养dayll 543.21±131.11μm和70.48±2.89μm,培养d11卵泡存活率为92.23%（273/296）,d6有腔形成率为67.91%（201/296）,d11有腔形成率为75.67%（224/296）,COCs排出率为44.93%（133/296）。大鼠卵泡体外发育形态学变化:体外培养大鼠卵泡形态学上经历了腔前卵泡、有腔卵泡、排卵前卵泡、卵丘细胞—卵母细胞复合体（COCs）排出、卵母细胞成熟和极体排出的形态学变化,与体内卵泡发育特征一致。3.大鼠卵泡体外激素分泌情况收集D4、6、8、10、12更换的培养基测定卵泡激素E2;D10、D12、D13更换的培养基测定卵泡激素P,每个时间点收集1-3个样品。E2和P的检测采用磁性酶联免疫法,E2抗体用17β-oestradiol,质控管在600～900pg/ml;P质控管在7～13ng/ml。体外培养卵泡从d4天开始检测到E2增加,并且随着培养时间延长持续增加,d8～11维持在较高水平;d11诱导排卵刺激后P分泌量急剧增加。体外培养卵泡分泌E2和P激素与体内卵泡激素分泌特征一致。4.大鼠卵母细胞体外成熟研究显示,IVG组7.44%（9/121）卵母细胞不能恢复成熟,停止在GV期,57.02%（69/121）停止减数分裂在GVBD期,35.53%（43/121）卵泡发出PB,而IVM组1.86%（6/322）的卵母细胞不能恢复成熟,停止在GV期,40.06%（129/322）停止在减数分裂GVBD期,56.21%（181/322）卵泡发出PB;没有一个卵母细胞完全发育成染色体不分离的超倍体。从卵泡发育、激素合成和卵母细胞成熟三方面以及参照小鼠培养方法的判断方法,显示本研究建立的大鼠腔前卵泡体外培养方法是成功的。三、大鼠卵泡体外方法作为毒性检测系统的初步验证由于本研究建立的小鼠卵泡体外培养方法在卵母细胞PB形成率上尚达不到国外水平,有待改进。另一方面,本研究建立的大鼠体外卵泡培养方法多项指标明显较小鼠卵泡培养效果好,加上大鼠是生殖毒性实验中最常使用的动物。因此,本研究在目前的条件下首先选择大鼠卵泡体外培养方法用于化学物雌性生殖毒性及其机制的研究。本研究选择氯化镉、DEHP、MEHP和噻氨酯哒唑Nocodazole四种卵巢毒物,根据受试物作用特征,观察其对大鼠卵泡的体外毒性。1.氯化镉镉是一种常见的工业毒物和环境污染物,动物实验表明镉可干扰卵巢内分泌功能,使大鼠动情周期延长,卵巢组织形态结构发生改变;可以抑制卵泡的正常生长发育,抑制雌性动物排卵,造成暂时性不育;可以通过促使体内颗粒细胞凋亡而诱导卵泡闭锁,进而对卵母细胞的成熟、排卵等造成影响。体外实验表明氯化镉可以抑制大鼠颗粒细胞孕酮的合成。本研究从氯化镉对卵泡发育、激素合成和不同发育阶段卵泡的影响三个方面研究氯化镉的卵巢毒性及其可能的作用机制。1.1氯化镉对卵泡发育影响实验设氯化镉0.1～1.6μg/mL 5个浓度和溶剂对照,每组16～20个卵泡,三次重复。在培养d2暴露氯化镉后卵泡在体外连续培养11d,隔天换1/2液,收集隔天更换的培养液d4、8、11检测E2激素,d11、12检测P。观察卵泡发育的形态学变化、测定d11卵泡存活率、有腔形成率和异常卵泡形成率,诱导排卵后测定COCs排出率。结果显示:形态学上可以观察到1.6μg/ml氯化镉出现较为明显细胞毒性,细胞呈圆形不能贴壁,突出培养板底部,基底膜模糊、缺损或消失,颗粒细胞松散或游离到卵泡外,卵泡轮廓不规则卵泡内出现黑色坏死区,卵母细胞逸出卵泡、变形、萎缩或崩解退化表现。暴露0.8-1.6μg/ml氯化镉对卵泡分泌E2含量无明显影响,但可以明显降低P的分泌量,与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）,说明氯化镉可以抑制卵泡合成孕激素P。暴露1.2μg/mL以上氯化镉后d11卵泡存活率（66.44±3.95%）出现下降,与对照组（91.57±1.32%）比较差异有统计学意义（P＜0.05）,剂量与卵泡存活率之间存在一定的相关性,相关系数R2为0.90;异常卵泡出现率（33.57±3.95%）明显升高,与对照组（8.44±1.32%）比较差异有统计学意义（P＜0.05）;暴露1.6μg/mL氯化镉后d11有腔卵泡形成率（42.51±6.66%）明显减少,与对照组（79.68±6.62%）比较差异有统计学意义（P＜0.05）;COCs排出率下降（24.99±3.95%）,与对照组（52.78±8.45%）比较差异有统计学意义（P＜0.05）。1.2氯化镉对不同发育阶段卵泡的影响本实验根据大鼠卵泡体外发育形态学变化,以卵泡不同阶段发育阶段d2（腔前卵泡阶段）、d6（有腔卵泡阶段）、d11（排卵前卵泡阶段）为暴露时间点,研究氯化镉影响卵泡发育和卵母细胞成熟的敏感阶段;根据第一部分实验选择氯化镉0.8、1.2和1.6μg/ml三个浓度组和溶剂对照组,暴露氯化镉后卵泡在体外继续培养到d11,隔天换1/2液,每组16～20个卵泡,三次重复。结果显示:d2暴露1.6ug/mL氯化镉,培养到d11有腔卵泡形成率（42.51±6.66%）、存活率（52.51±7.84%）比d6有腔卵泡形成率（74.24±6.98%）、存活率（81.75±8.13%）减少,而异常卵泡率（47.49±7.48%）比day6异常卵泡率（18.23±8.17%）增加,差异有统计学意义（P＜0.05）;卵母细胞发育停止在GV阶段（58.34±11.79%）,明显比d6（15.66±9.28%）、d11（20.2±2.86%）时间点数量增加,差异有统计学意义（P＜0.05）。d6暴露氯化镉对卵泡发育、排卵和卵母细胞发育成熟无明显影响;虽然在相同浓度下,三个时间点暴露氯化镉对PB影响无明显差异,但d11暴露0.8-1.6μg/ml氯化镉对PB形成率的影响有一定剂量反应趋势,而IVM组1.6μg/mL氯化镉使PB减少（34.11±0.34%）,与对照组（67.98±6.57%）比较差异有统计学意义（P＜0.05）。以上结果说明卵泡不同发育阶段暴露一定剂量氯化镉对卵泡发育和卵母细胞成熟有一定影响:腔前卵泡阶段暴露氯化镉可以影响卵泡发育和卵母细胞的发育成熟（处于GV期）,有腔卵泡阶段暴露氯化镉对卵泡发育和卵母细胞成熟无明显的影响,排卵前卵泡阶段暴露氯化镉可以影响卵泡排卵和卵母细胞PB形成。2.邻苯二甲酸二（2一乙基己基）酯（DEHP）和邻苯二甲酸单（2一乙基己基）酯（MEHP）DEHP和MEHP属于邻苯二甲酸酯类。动物实验发现DEHP的雌性生殖毒性作用主要是通过其代谢产物MEHP影响卵巢功能,作用位点主要是卵巢颗粒细胞。MEHP可显著抑制排卵前期颗粒细胞产生雌二醇,MEHP与大鼠颗粒细胞共同培养24小时后在降低孕酮分泌量的同时,也可以降低FSH诱导的cAMP蓄积量40%,孕酮分泌量的下降与MEHP存在剂量一效应关系。本研究中MEHP设2.5～80μg/mL 6个浓度,DEHP设33.7～1000nM 6个浓度,同时设DMSO溶剂对照和阴性对照。每组16～20个卵泡,三次重复。在培养d2分别暴露化学物后卵泡在体外连续培养11天,隔天换1/2液,测定d11天卵泡存活率、有腔形成率、异常卵泡形成率和COCs排出率。结果显示DEHP对d11天卵泡存活率、有腔形成率、异常卵泡形成率和COCs排出率无明显的影响,与溶剂对照无显著性差异（P＞0.05）。对照组和DMSO组也无统计学差异。d2暴露＞10μg/mL以上剂量的MEHP 48h后,d11卵泡存活率明显下降（54.76±3.37%）,与对照组（91.57+1.32%）比较差异有统计学意义（P＜0.05）,剂量与卵泡存活率之间存在一定相关性,相关系数R2为0.92;COCs排出（24.99±3.95%）明显减少,与对照组（52.78±8.45%）比较差异有统计学意义（P＜0.05）;异常卵泡出现率（45.24±3.37%）明显升高,与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）;暴露＞20μg/mL MEHP有腔形成率（46.18±1.67%）减少,与对照组（85.91±5.03%）比较差异有统计学意义（P＜0.05）,且有明显剂量反应关系。本研究结果还说明大鼠卵泡体外培养方法不具有代谢活化能力,对需经代谢的间接生殖毒物可能需要加体外代谢活化系统,有待进一步研究。3.噻氨酯哒唑（Nocodazole）噻氨酯哒唑是一种干扰微管组装合成的抗肿瘤药物。和秋水仙素在β-tubulin上Arg-390竞争结合同一结合位点,直接影响微管聚合作用和微管依赖性进程。可以导致细胞周期永久性或短暂阻滞,以往研究证实噻氨酯哒唑可以明显地增加抑制在第一次减数分裂的卵泡数。本研究在卵泡培养d11加含终浓度为10、20、40nM噻氨酯哒唑暴露20h后观察卵泡排卵和卵母细胞成熟情况。结果显示:ⅣM组,COCs暴露100nM噻氨酯哒唑20h后出现卵母细胞细胞毒性,＞5nM出现PB排出（23.19±14.35%）明显下降,与对照（67.96±6.57%）组比较差异有显著意义（P＜0.05）:腔前卵泡培养d11天暴露40nM噻氨酯哒唑后卵泡排出COCs数减少,与对照组比较差异无统计学意义,但存在剂量反应关系,说明噻氨酯哒唑可抑制卵泡排出COCs;同时,噻氨酯哒唑可以抑制减数分裂恢复,PB排出减少（19.35%）,与对照组（37.78%）比较差异有统计学意义。本研究用大鼠卵泡体外培养方法进一步揭示了四种卵巢毒物对卵泡发育、激素形成和卵母细胞成熟的影响,以及对不同发育阶段卵泡的毒作用特征,初步验证了大鼠腔前卵泡体外培养方法用于雌性生殖毒物鉴定和机制研究的可行性。1、基本建立了小鼠腔前卵泡体外培养方法。2、建立了大鼠腔前卵泡体外培养方法,国内外文献尚未报道比较完整地观察大鼠卵泡发育过程和卵子形成的体外培养系统。3、用大鼠腔前卵泡培养方法观察了四种化学物对卵泡发育、激素合成和卵子形成的影响,以及对不同发育阶段卵泡的毒作用。进一步揭示了氯化镉、DEHP、MEHP、噻氨酯哒唑四种卵巢毒物的雌性生殖毒作用特征,为阐明其毒作用机制提供了某些依据。4、初步提出一个以卵泡形态学改变、卵泡分化阶段、卵泡存活率、卵丘细胞粘液化、激素（E2、P）分泌量、卵母细胞直径、极体形成率为评价指标的大鼠腔前卵泡体外毒性研究系统。该系统可有效鉴定卵巢毒物,并可用于毒物作用阶段、作用特征等机制的研究,具有良好的潜在应用前景。由于该试验系统周期短、所用实验动物少、简便、受试物用量少,待进一步完善试验条件、优化评价指标和不同类型雌性生殖毒物验证后有望成为一种雌性生殖毒性的体外试验系统或替代方法。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略词
• 前言
• 研究的总体设计
• 研究构思
• 技术路线
• 第一部分 小鼠腔前卵泡体外培养方法的建立
• 一、材料和方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 第二部分 大鼠腔前卵泡体外培养方法的建立
• 一、材料和方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 第三部分 大鼠卵泡体外方法作为毒性检测系统的初步验证
• 一、材料和方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢
• 综述