在抗体免疫选择压下ALV-Jgp85基因的变异及中国野毒株的分离鉴定

论文摘要

J亚群禽白血病病毒（Subgroup J of Avian Leukosis Virus, ALV-J）是90年代初从商品代肉鸡中分离鉴定出来的禽白血病病毒（Avian LeukosisVirus, ALV）新的亚群,根据病毒中和试验、交叉干扰试验和基因组序列,确定它与经典的ALV不同,ALV-J主要引起肉鸡的骨髓瘤白血病（MyloidLeucosis, ML）。 迄今为止,已有许多关于ALV-J的囊膜糖蛋白基因分子流行病学的报道,在这些报道中,都是比较了大量野毒株的gp85基因的氨基酸序列,并根据其有义突变（NS）与沉默突变（S）的比例来分析gp85基因上存在的高变区,并以此来显示免疫选择压作用在病毒变异和演化中的作用。本试验首次尝试在严格试验控制条件下显示抗体这一免疫选择压对ALV-J变异的影响。 将ALV-J中国分离株NX0101接种7日龄SPF鸡,饲养在SPF隔离罩中,42天后采血,用IFA试验测其对ALV-JNX0101株的抗体效价,取抗体水平最高的一份作为抗体免疫选择压的来源。通过这份血清的病毒中和试验,确定完全抑制病毒复制的最大抗体稀释度为1∶25,用1∶50作为加入到培养基中去的抗体浓度,构成抗体免疫选择压。为了完成该试验,将已完成env基因序列测定的原代病毒NX0101（NX-0）接种鸡胚成纤维细胞（CEF）,分为A组（培养基中无抗体）和B组（培养基中含1∶50的抗ALV-J血清）,每组设3个独立的传代系列,病毒在细胞上每培养6d记为一代。分别对第10代、第20代和第30代病毒的囊膜糖蛋白（env）基因进行了克隆和测序,并将传代病毒的gp85蛋白的氨基酸序列与原代病毒进行了比较,并通过计算NS与S的比值,以显示抗体免疫选择压对ALV-Jgp85基因变异的影响。 原始病毒与无抗体A组不同传代系列的不同代次之间gp85蛋白的氨基酸序列同源性为97.7%～99.7%;而原始病毒与有抗体B组不同传代系列的不同代次之间gp85的氨基酸序列同源性为93.8%～96.1%;在与不含抗体的细胞上连续传代相比,抗体的存在不仅造成了gp85基因上三个高变区氨基酸变异增多,而且还在aa#143～146的连续四个位点上均出现了完全不同的氨基酸残基;有抗体B组的变异明显要大于无抗体的A组,

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 1 禽白血病病毒的基本概况
• 2 ALV-J分子病毒学特性
• 3 ALV-J的致病性及其免疫抑制作用
• 4 ALV-J的鉴别与诊断
• 5 ALV-J囊膜糖蛋白基因的变异
• 6 免疫选择压对病毒演化的影响
• 7 ALV-J的控制与消灭
• 8 本研究的目的及意义
• 9 附图
• 研究内容
• 试验一 在抗体免疫选择压作用下鸡J亚群白血病病毒gp85基因的变异
• 1 材料与方法
• 1.1 鸡胚成纤维细胞（CEF）的制备
• 1.2 ALV-J中国分离株NX0101
• 1.3 单克隆抗体
• 1.4 异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗鼠和兔抗鸡二抗
• 1.5 引物
• 1.6 鸡抗ALV-J NX0101单因子血清的制备及其效价的测定
• 1.7 单因子血清中ALV-J病毒的检测
• 1.8 抗体在37℃温箱中36h后的抗体效价
• 1.9 ALV-J NX0101株单因子血清的病毒中和试验
• 1.10 在含有单因子血清的CEF上NX0101株的连续传代
• 1.11 第10代、20代和30代病毒env基因的扩增、克隆与测序
• 1.11.1 克隆载体和宿主菌
• 1.11.2 分子生物学试剂
• 1.11.3 第10代、20代和30代病毒模板的制备
• 1.11.4 第10代、20代和30代病毒env基因的扩增
• 1.11.5 第10代、20代和30代病毒env基因PCR产物DNA电泳
• 1.11.6 PCR产物的回收与定量
• 1.11.7 DNA的连接反应
• 1.11.8 TG1大肠杆菌感受态细胞的制备
• 1.11.9 连接产物的转化
• 1.11.10 质粒DNA的提取
• 1.11.11 重组质粒DNA的酶切鉴定
• 1.11.12 阳性克隆序列测定
• 2 结果
• 2.1 鸡抗NX0101株病毒单因子血清的效价
• 2.2 单因子血清中ALV-J病毒的检测
• 2.3 培养基中不完全抑制ALV-J复制的最适血清浓度的确定
• 2.4 抗体在37℃温箱中36h后的抗体效价
• 2.5 第10代、20代和30代病毒env基因PCR扩增结果
• 2.6 第10代、20代和30代病毒env基因重组质粒的双酶切鉴定结果
• 2.7 在不含抗体培养基上连续传代病毒gp85基因的变异
• 2.8 在含抗体的培养基上连续传代病毒gp85基因的变异
• 2.9 原代病毒分别与有、无抗体组gp85氨基酸序列差异性程度比较
• 2.10 不同传代系列高变区上重复变异位点的规律
• 2.11 gp85及其3个高变区上NS与S的比值
• 试验一 附图
• 试验二 ALV-J田间野毒株的分离鉴定及1999-2003年期间我国ALV-J野毒株gp85基因变异趋势
• 1 材料与方法
• 1.1 鸡胚成纤维细胞（CEF）的制备
• 1.2 病料来源
• 1.3 单克隆抗体
• 1.4 异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗鼠二抗
• 1.5 引物
• 1.6 阳性对照ALV-J病毒
• 1.7 病毒分离鉴定
• 1.7.1 病毒分离与复制
• 1.7.2 间接免疫荧光试验（IFA）
• 1.7.3 细胞DNA的提取
• 1.7.4 特异性2.2kb条带扩增
• 1.7.5 PCR产物DNA电泳
• 1.8 env基因的克隆与测序
• 1.8.1 克隆载体和宿主菌
• 1.8.2 分子生物学试剂
• 1.8.3 PCR产物的回收与定量
• 1.8.4 DNA的连接反应
• 1.8.5 TG1大肠杆菌感受态细胞的制备
• 1.8.6 连接产物的转化
• 1.8.7 质粒DNA的提取
• 1.8.8 重组质粒DNA的酶切鉴定
• 1.8.9 阳性克隆序列测定
• 1.9 1999—2003年期间分离的中国野毒株的背景
• 2 结果
• 2.1 用ALV-J特异性单克隆抗体IFA检测结果
• 2.2 特异性2.2kb条带扩增结果
• 2.3 重组质粒的双酶切鉴定结果
• 2.4 14个ALV-J中国分离株与原型株HPRS-103的Gp85蛋白氨基酸序列分析
• 2.5 十四个ALV-J中国分离株与原型株HPRS-103的Gp85蛋白氨基酸序列的同源性比较
• 2.6 14株中国野毒株Gp85蛋白的氨基酸序列的遗传进化关系
• 2.7 ALV-J中国野毒株的变异趋势
• 2.8 免疫选择压对gp85基因变异的影响
• 附图
• 3.讨论
• 3.1 试验一讨论
• 3.2 试验2讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士研究生期间的论文情况