盾壳霉代谢抗水稻白叶枯活性物质的结构分析

论文摘要

水稻白叶枯是一种危害世界多个地区的病害,该病害的致病菌为革兰氏阴性的细菌（黄单胞杆菌）,目前全世界都在为防治这一病害而努力。盾壳霉是一种重要的生防真菌,目前其生物防治研究主要集中在拮抗真菌病害核盘菌领域中,关于盾壳霉拮抗革兰氏阴性细菌病害的报道非常少见。姜道宏等发现盾壳霉菌株chy-1可以代谢能够抑制多种病害的活性物质,特别是针对白叶枯病菌具有较好的抑制活性。研究显示chy-1代谢产物的活性比较稳定,可以耐受121℃的温度处理,耐酸不耐碱。王虹研究了该代谢产物整体的稳定性,发现其活性在经过时间、温度和光照处理后仍然可以保持较好,同时探索了有效物质的提取方法,提取溶剂的选择。同时将紫外分光光度法与该物质的生物活性结合起来,建立了一种快速检测盾壳霉活性物质的方法,并对该物质的结构进行了初步的推测。鉴于该代谢产物活性的特殊性,获得其纯品和具体的分子结构信息变得十分的迫切。本研究在此基础上,首先研究盾壳霉chy-1的培养条件,获得盾壳霉chy-1大量的代谢产物,用溶剂法提取获得具有活性的粗提物。利用层析法,结合生物活性测试,对该粗提物进行了分离纯化并讨论了该目标物的物化性质,最后完成结构测试并初步解析了该活性物质的结构。主要的研究内容与结果如下：1.利用PDB液态培养基发酵的方式,于摇床中20℃、180r/min条件下培养两周获得盾壳霉的发酵液10L,讨论了PDB液体发酵相对麦粒固体发酵的差别。结果发现液体发酵获取代谢产物的方式相对固体发酵方式具有培养速度快、后续操作工作量小和节约提取溶剂的优点。2.选择无水乙醚为提取溶剂,获得具有活性的混合物。使用薄层分析法得到石油醚和乙酸乙酯的梯度洗脱比例,利用柱层析分离的方式对粗提物进行粗分和细分,后用石油醚与乙酸乙酯一定比例的洗脱体系与制备薄层层析法对目标产物进行纯化,结果得到高纯度的目标物。结合前人研究结果分析了无水乙醚与正丁醇、甲醇在研究过程中的差别,认为无水乙醚相对后两者具有处理方便,毒性较小,不会对活性测试结果产生干扰的优势。3.对目标产物进行了纯度分析。利用薄层层析的方式初步确定该物质的纯度,并利用高效液相色谱法确定该物质的纯度,结果确定该目标产物具有较高的纯度。具体分析了该物质的稳定性,发现当该物质存在于室温条件下时,可能会与空气中的物质发生反应或者自身结构发生转变。虽然会发生上述变化,该物质的活性位点却得以保存,这一现象保证了该物质的活性不会完全丢失,活性保持较好。4.对该物质进行了红外、紫外、质谱和核磁共振四种方式的结构测试。研究结果发现该物质的红外吸收峰、紫外吸收峰与质谱的数据与macrosphelide A非常接近,只是在比对核磁氢谱数据时发现,对比与macrosphelide A,该物质在8-C上的羟基峰消失,推测结果为该物质是macrosphelide A的同系物,只是与macrosphelide B不同的是,该物质被氧化是8-C而不是14-C,该物质应该是从盾壳霉菌株中分离出来的macrosphelide A新的同系物。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1. 前言
• 1.1. 水稻白叶枯病的防治进展
• 1.1.1. 水稻白叶枯病概述
• 1.1.2. 水稻白叶枯病的防治
• 1.2. 盾壳霉代谢产物的研究进展
• 1.2.1. 盾壳霉简介与代谢产物研究进展
• 1.2.2. 抗真菌代谢产物的研究
• 1.2.3. 抗细菌代谢产物的研究
• 1.3. 代谢产物的提取、分离纯化和结构鉴定
• 1.3.1. 代谢产物的提取方法
• 1.3.2. 代谢产物的分离纯化方法
• 1.3.3. 代谢产物的结构鉴定方法
• 1.4. 研究意义与研究内容
• 1.4.1. 研究意义
• 1.4.2. 研究内容
• 2. 供试菌株与培养基
• 3. 研究部分
• 3.1. 盾壳霉的活化与发酵
• 3.1.1. 试验材料
• 3.1.2. 盾壳霉的活化与菌丝匀浆的制备
• 3.1.3. 盾壳霉的发酵
• 3.1.4. 结果与分析
• 3.2. 盾壳霉代谢产物的提取
• 3.2.1. 试验材料
• 3.2.2. 培养液与菌丝分离
• 3.2.3. 活性物质的提取与浓缩
• 3.2.4. 粗提产物的活性测试
• 3.2.5. 结果与分析
• 3.3. 活性代谢产物的分离提纯
• 3.3.1. 试验材料
• 3.3.2. 活性代谢产物的粗分
• 3.3.3. 粗分组分的活性测试
• 3.3.4. 结果与分析
• 3.3.5. 活性物质的第二次柱层析
• 3.3.6. 结果与分析
• 3.3.7. 活性组分的制备薄层纯化
• 3.3.8. 结果与分析
• 3.4. 纯度分析
• 3.4.1. 试验材料
• 3.4.2. 薄层层析法
• 3.4.3. HPLC的纯度分析方法
• 3.4.4. 结果与分析
• 3.5. 理化性质分析
• 3.6. 产物的结构分析
• 3.6.1. 红外分析
• 3.6.2. 紫外分析
• 3.6.3. 质谱分析
• 3.6.4. 核磁共振分析
• 3.6.5. 结果与分析
• 4. 讨论
• 4.1. 活性与理化性质的比对分析
• 4.1.1. 活性的比对分析
• 4.1.2. 理化性质比对分析
• 4.2. 结构测试结果比对分析
• 5. 结论
• 6. 参考文献
• 待发表文章
• 致谢