伏马菌素B1免疫学快速检测方法的研究

论文摘要

目前，真菌毒素已经成为食品中重要的污染源之一，其中伏马菌素（Fumonisins，F）是污染较为严重的真菌毒素之一，它是一组主要由串珠镰刀菌、多育镰刀菌等镰刀菌在一定条件下繁殖所产生的代谢毒物，其主要成分为伏马菌素B1（FB1），并且大多存在于粮食和饲料中。伏马菌素不仅具有肝肾毒性和肺毒性，而且具有神经毒性、免疫系统毒性和致癌性等强烈毒性，因此粮食及其制品中伏马菌素的污染会对畜牧业的健康发展以及人类的身体健康造成严重的威胁。目前常用于检测伏马菌素B1的方法有薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等，但这些方法都具有很多缺点，如需要对样品进行复杂的前处理过程、需要价格高昂仪器设备、需要消耗大量时间、需要大量的人力物力等等，因此建立针对伏马菌素的免疫学快速检测方法就显得尤为重要。本研究在制备伏马菌素B1人工抗原的基础之上，通过单克隆抗体技术筛选出了抗伏马菌素B1的单克隆抗体，建立了伏马菌素B1的间接竞争ELISA检测方法，制备了检测伏马菌素B1的间接竞争ELISA快速检测试剂盒。1、伏马菌素B1人工抗原的合成及多抗血清的制备采用碳二亚胺（EDC）法将FB1与载体蛋白偶联合成了人工抗原，经过SDS-PAGE凝胶电泳鉴定，偶联蛋白的迁移速率远远小于载体蛋白，说明偶联成功，然后用免疫抗原免疫小鼠，成功制备了效价高达1:5.12×104、半数抑制浓度IC50为61.3ng/mL的FB1多克隆抗血清。2、伏马菌素B1单克隆抗体的制备及其特性鉴定在成功制备伏马菌素B1人工抗原并且制备出敏感性好，特异性强的鼠源多克隆抗血清的基础之上，通过单克隆抗体技术成功地进行了小鼠脾细胞与NS0骨髓瘤细胞的细胞融合，利用间接ELISA方法和间接竞争ELISA方法筛选出了1G11和2G12两株能够产生FB1mAb的杂交瘤细胞株，它们的细胞上清效价为1:2.56×104和1:1.28×104。将1G11杂交瘤细胞通过腹腔注射到腹部有石蜡的小鼠体内，使杂交瘤细胞在小鼠体内大量增殖，并分泌特定的单克隆抗体，采集的腹水效价可以达到1:5.12×105。经鉴定，该单克隆抗体的亚型为IgG1型，亲和常数Ka为2.7×1010L/mol，对伏马菌素B1的半数抑制浓度IC50可以达到6.56ng/mL，并且与其他毒素竞争物的交叉反应率均低于1%。表明试验获得了效价、敏感性、特异性和亲和力都较为显著的FB1mAb。3、伏马菌素B1间接竞争ELISA检测试剂盒的制备通过间接竞争ELISA方法确定了抗原包被浓度为1:1000稀释，抗体工作浓度为1:30000稀释，建立了间接竞争ELISA检测方法，并且制备了伏马菌素B1间接竞争ELISA快速检测试剂盒。试剂盒的各项性能良好，其中标准曲线线性回归方程的相关系数为0.9856，灵敏度可以达到2.1ng/mL，添加回收率在80%以上，变异系数小于15%，交叉反应率小于1%，结果表明本研究制备的FB1-Kit灵敏度好，准确度高，特异性强，并且具有很好的稳定性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 文献综述
• 1.1 伏马菌素概述
• 1.1.1 伏马菌素的分类
• 1.1.2 伏马菌素的产生及理化性质
• 1.1.3 伏马菌素的吸收与代谢
• 1.2 伏马菌素的污染情况
• 1.3 伏马菌素的危害
• 1.3.1 肝肾毒性
• 1.3.2 肺毒性
• 1.3.3 致癌性
• 1.3.4 神经毒性
• 1.3.5 免疫系统毒性
• 1.3.6 生殖毒性
• 1.3.7 伏马菌素毒性作用机理
• 1.4 伏马菌素的检测
• 1.4.1 伏马菌素的限量标准
• 1.4.2 伏马菌素的检测方法
• 1.5 本研究的目的和意义
• 1.6 本研究的主要内容和技术路线
• 1.6.1 本研究的主要内容
• 1.6.2 本研究的技术路线
• 1人工抗原的合成及多抗血清的制备'>第2章 伏马菌素 B₁人工抗原的合成及多抗血清的制备
• 2.1 材料
• 2.1.1 试剂
• 2.1.2 溶液
• 2.1.3 仪器
• 2.1.4 试验动物
• 2.2 方法
• 2.2.1 人工抗原的制备
• 2.2.2 人工抗原的鉴定
• 1多抗血清的制备'>2.2.3 FB₁多抗血清的制备
• 1多抗血清的鉴定'>2.2.4 FB₁多抗血清的鉴定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 人工抗原的鉴定结果
• 2.3.2 多抗血清的鉴定结果及分析
• 2.4 讨论
• 1人工抗原的制备方法'>2.4.1 伏马菌素 B₁人工抗原的制备方法
• 1人工抗原的鉴定方法'>2.4.2 伏马菌素 B₁人工抗原的鉴定方法
• 2.4.3 免疫剂量的选择
• 2.5 本章小结
• 1单克隆抗体的制备及其特性鉴定'>第3章 伏马菌素 B₁单克隆抗体的制备及其特性鉴定
• 3.1 材料
• 3.1.1 试剂
• 3.1.2 溶液
• 3.1.3 仪器
• 3.1.4 实验动物与小鼠骨髓瘤细胞
• 3.2 方法
• 3.2.1 杂交瘤细胞株的建立
• 3.2.2 大量制备单克隆抗体
• 3.2.3 单克隆抗体免疫学特性的鉴定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 杂交瘤细胞株的建立
• 3.3.2 单克隆抗体效价的测定结果
• 3.3.3 单克隆抗体敏感性的鉴定结果
• 3.3.4 单克隆抗体特异性的将定结果
• 3.3.5 单克隆抗体亲和力鉴定结果
• 3.3.6 单克隆抗体亚型鉴定结果
• 3.4 讨论
• 3.4.1 关于细胞融合和杂交瘤细胞的筛选
• 3.4.2 关于超免途径和超免剂量的选择
• 3.5 本章小结
• 1间接竞争 ELISA 检测试剂盒的制备'>第4章 伏马菌素 B₁间接竞争 ELISA 检测试剂盒的制备
• 4.1 材料
• 4.2 方法
• 4.2.1 间接竞争 ELISA 试验方法的建立
• 4.2.2 间接竞争 ELISA 检测试剂盒的配置与检测
• 4.2.3 样品的前处理
• 4.2.4 间接竞争 ELISA 检测试剂盒特性的鉴定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 抗原包被浓度和抗体工作浓度的确定结果
• 4.3.2 间接竞争 ELISA 方法反应体系的确定结果
• 1-Kit 检测步骤的确定结果'>4.3.3 FB₁-Kit 检测步骤的确定结果
• 1-Kit 各项性能的鉴定结果'>4.3.4 FB₁-Kit 各项性能的鉴定结果
• 4.4 讨论
• 4.4.1 关于间接竞争 ELISA 试验方法的建立
• 4.4.2 关于间接竞争 ELISA 检测试剂盒特性的鉴定
• 4.5 本章小结
• 第5章 结论
• 参考文献
• 缩略语词汇表
• 致谢
• 攻读硕士学位期间的研究成果