论文摘要
根据C.J.Mclnnes等于1990年发表的绵羊IFN-γ基因序列设计并合成引物,以经ConA诱导的绵羊（湖羊）脾脏淋巴细胞提取的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出长度为554bp的目的基因片段。将该基因克隆到pMD18-T载体上,经PCR、酶切鉴定和序列测定,结果表明获得了绵羊IFN-γ基因的克隆。该基因包含绵羊IFN-γ基因的全长为501个碱基的开放阅读框,编码166个氨基酸组成的功能蛋白。克隆到的绵羊IFN-γ基因与GenBank上已公布的人、牛、山羊、马鹿、马、骆驼、猪、狗、猫和鸡的IFN-γ核苷酸序列进行比较,其同源性分别为75.2﹪、96.6﹪、99.0﹪、95.8﹪、83.0﹪、88.8﹪、86.6﹪、82.4﹪、53.9﹪、32.9﹪;氨基酸序列同源性分别为61.7﹪、94.6﹪、98.2﹪、92.2﹪、77.8﹪、86.8﹪、77.8﹪、76.0﹪、39.5﹪、6.7﹪。与已发表的其它品种绵羊相比较,核苷酸和氨基酸序列同源性都为100%。将绵羊IFN-γ基因亚克隆,插入到原核表达载体pPROEXHTa中,构建成绵羊IFN-γ基因原核表达重组质粒pPROEXHTa-OvIFN-γ。经PCR、双酶切鉴定,表明所构建的重组质粒为阳性。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,阳性菌落筛选后,以IPTG为诱导剂进行诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot分析,结果显示,在分子量约为22.6 kDa处有明显的蛋白质表达条带,与预期的融合表达蛋白大小一致。表达的融合蛋白主要以不溶性包涵体形式存在,约占菌体总蛋白的48%。说明基因工程菌株BL21（DE3）/pPROEXHTa-OvIFN-γ能够高效表达绵羊IFN-γ融合蛋白。通过对绵羊IFN-γ原核表达产物的提取、纯化和复性,获得了活性蛋白。采用细胞病变抑制法测定了复性蛋白抗牛病毒性腹泻病毒（BVDV）活性。结果显示,复性蛋白具有抗BVDV活性,抗BVDV活性为1.0×107U/mL。