CIRP过表达和干扰慢病毒载体的构建与分析

论文摘要

冷诱导RNA结合蛋白（Cold inducible RNA-binding Protein,CIRP）是Nishiyam H（1997）等从冷处理的BALB/3T3鼠成纤维细胞中分离和鉴定出的第一种哺乳动物冷休克蛋白，并发现降低温度可以使这种蛋白的表达升高，而升高温度则使其表达水平下降。近年来人们发现不论是在冷应激等各种应激条件下还是在低温治疗过程中CIRP都发挥着保护机体的积极作用。我们认为CIRP发挥作用的分子机制研究是揭示冷应激机理和亚低温治疗广泛推广的瓶颈。本研究构建了大鼠CIRP基因的RNAi载体和CIRP过表达慢病毒载体，并进行了大鼠海马神经元的原代培养，为评估其在原代大鼠海马神经元中对CIRP基因的沉默和过表达效果奠定了基础。（1）首先构建CIRP的过表达载体：从4℃8小时冷处理的SD大鼠睾丸组织中获得CIRP基因的cDNA序列，利用常规分子克隆方法将其连接到入门载体pENTR-11上，获得入门克隆pENTR-11-CIRP。入门克隆pENTR-11-CIRP与目标载体pLenti6/V5-DEST发生Gateway技术的同源重组LR反应，获得CIRP过表达载体pLenti6/V5-CIRP。（2）构建CIRP的RNAi干扰载体：利用软件设计并合成5对CIRP序列特异性pre-miRNA双链，并将双链前体克隆到线性质粒表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR，获得5条干扰载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-CIRP-131/264/405/645/707。（3）进行大鼠海马神经元的原代培养，为后期研究CIRP在神经细胞中的功能奠定了基础。实验结果：（1）成功构建CIRP基因的过表达克隆载体pLenti6/V5-CIRP。（2）成功构建5条干扰载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-CIRP-131/264/405/645/707。（3）优化和改良了大鼠海马神经元的原代培养方法，为后期的实验研究奠定了技术平台。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩写词表
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 冷刺激对动物机体相关蛋白表达的影响
• 1.2 CIRP 的结构及生物学功能
• 1.3 实验中采用的主要技术
• 第二章 CIRP 过表达载体 pENTR-11-CIRP 的构建
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 CIRPmiRNA 干扰质粒的构建及鉴定
• 3.1 材料
• 3.2 实验方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 原代大鼠海马神经元的培养
• 4.1 材料
• 4.2 方法
• 4.3 结果与分析
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 作者简介
• 个人情况
• 教育背景
• 读研期间参与的课题
• 读研期间参与发表的文章