论文摘要
甘油三酯水平升高作为冠状动脉硬化的独立致病因素,与冠心病、心肌梗塞和糖尿病等常见病都有密切联系。载脂蛋白AV（ApoAV）是和人血液中甘油三酯浓度息息相关的载脂蛋白A1/C3/A4/A5中的一员,它在人、狗、兔、鼠和禽类中都具有很高的保守性。ApoAV蛋白是唯一由肝脏分泌的蛋白,它虽然在体内含量非常低（约为ApoA1的千分之一）,但却能显著降低血液中甘油三酯的量。ApoAV的作用机制可能是通过引导极低密度脂蛋白VLDL和乳糜微粒CM黏合到结合了蛋白聚糖的脂蛋白酶上,通过促进脂蛋白酶分解活性而降低血液内甘油三酯含量。因此对该蛋白的研究具有相当重要的现实意义。从动物体内直接提取的ApoAV蛋白非常微量并且难溶,不利于进行生化试验,因此目前对它的研究还都只是局限在基因层次上。本课题从含有人源ApoAV编码基因的质粒出发,利用载体pSJ5和ppSUMO构建两个融合表达质粒,分别转化入表达宿主细胞大肠杆菌BL21（DE3）和Rosetta（DE3）中,经温度、诱导时间和诱导剂浓度等表达条件的优化实现了该蛋白的高效、可溶性表达。我们根据融合蛋白的特点和ApoAV的物理化学性质,经过两步镍柱和一步离子交换柱纯化获得了大量高纯度的ApoAV蛋白。圆二色谱（CD）分析证明该蛋白具有明显α-螺旋和β-折叠结构的,与二级结构预测的结果几乎完全吻合,表明制备的ApoAV折叠状态好,适合于进一步的生化实验、结构测定和功能研究。
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摘要ABSTRACT第一章 绪论1.1 APOAV 的介绍及其研究进展1.1.1 ApoAV 的发现及其结构1.1.2 ApoAV 的功能和ApoAV 基因多态性1.1.3 ApoAV 的研究进展1.2 本论文研究的目的、主要内容和意义第二章 重组质粒PSJ5-APOAV 和PPSUMO-APOAV 的构建2.1 材料2.1.1 培养基与抗生素2.1.2 菌种及载体2.1.3 试剂及试剂盒2.1.4 主要仪器设备2.1.5 主要试剂的配制2.2 实验方法2.2.1 实验基本方法2.2.2 目的基因制备2.2.3 pSJ5-ApoAV 和ppSUMO-ApoAV 表达质粒的构建和鉴定2.3 结果2.3.1 带酶切位点的 ApoAV 基因 PCR 扩增反应2.3.2 载体DNA 的限制性酶切2.3.3 重组质粒pSJ5-ApoAV 和ppSUMO-ApoAV 的鉴定2.4 讨论2.4.1 PCR 操作2.4.2 载体的选择2.5 本章小结第三章 TRXA-APOAV 和 SUMO-APOAV 蛋白的表达3.1 材料3.1.1 培养基与抗生素3.1.2 质粒和宿主菌3.1.3 主要试剂3.1.4 主要仪器3.1.5 主要试剂配制3.2 实验方法3.2.1 基本实验方法3.2.2 Rosetta （DE3）作为宿主的TrxA-ApoAV 的表达3.2.3 BL21（DE3）作为宿主的TrxA-ApoAV 的表达3.2.4 BL21（DE3）作为宿主的SUMO-ApoAV 的表达3.3 结果3.3.1 Rosetta （DE3）作为宿主的TrxA-ApoAV 的表达结果3.3.2 BL21（DE3）作为宿主的TrxA-ApoAV 的表达结果3.3.3 BL21（DE3）作为宿主的SUMO-ApoAV 的表达结果3.4 讨论3.4.1 蛋白可溶表达策略3.4.2 破菌液的选择3.5 本章小结第四章 APOAV 蛋白的纯化和表征4.1 材料4.1.1 菌体4.1.2 主要试剂4.1.3 主要仪器设备4.1.4 主要试剂的配制4.2 实验方法4.2.1 Rosetta（DE3）为宿主的TrxA-ApoAV 的纯化4.2.2 BL21（DE3）为宿主的TrxA-ApoAV 的纯化4.2.3 BL21（DE3）为宿主的SUMO-ApoAV 的纯化4.2.4 ApoAV 蛋白的圆二色谱分析4.3 结果4.3.1 Rosetta（DE3）为宿主的TrxA-ApoAV 的纯化结果4.3.2 BL21（DE3）为宿主的TrxA-ApoAV 的纯化结果4.3.3 BL21（DE3）为宿主的SUMO-ApoAV 的纯化结果4.3.4 ApoAV 蛋白的圆二色谱分析4.4 讨论4.4.1 蛋白纯化策略选择4.4.2 纯化过程中溶液的选择4.5 本章小结结论与展望1. 结论2. 创新点3. 展望参考文献缩略词对照表攻读硕士学位期间取得的研究成果致谢附件
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标签：载脂蛋白论文; 融合标签论文; 可溶表达论文; 圆二色谱论文;
