亚心型扁藻细胞核与叶绿体稳定转化系统的构建

论文摘要

亚心型扁藻,又称亚心型四爿藻,是一种单细胞海洋绿藻。该藻在水产养殖、新能源开发等方面有重要的应用价值。为了推动该藻的基础研究进程并提高其应用价值,本文对亚心型扁藻的细胞核与叶绿体遗传转化体系进行了较系统的研究。首先通过亚心型扁藻对多种常用抗生素和除草剂草丁膦的敏感性实验,确定以草丁膦为筛选压力,其抗性基因bar基因为选择标记基因,构建亚心型扁藻核遗传转化系统。本文采用基因枪转化法和珠磨法两种方法建立亚心型扁藻的核遗传转化系统。珠磨法转化需要以原生质体为材料,所以我们用鲍鱼酶液去除亚心型扁藻的细胞壁制备原生质体;然后用珠磨法将pEGFP-N1质粒导入原生质体中,观察到了绿色荧光蛋白的瞬间表达,证明珠磨法可用来建立亚心型扁藻的核遗传转化系统。然后利用基因枪法和珠磨法将含有bar基因的质粒pSVB导入亚心型扁藻中,通过草丁膦筛选得到稳定转化的抗性单藻落。根据统计结果发现,珠磨法的转化效率高于基因枪法。本文采用基因枪法建立了亚心型扁藻的叶绿体遗传转化系统。首先克隆了亚心型扁藻的叶绿体基因组片段rrn16S-trnI和trnA-rrn23S作为同源整合区域;从莱茵衣藻叶绿体转化载体p64D上克隆启动子5’atpA和终止子3’rbcL,作为调控序列;以绿色荧光蛋白基因（gfp）为报告基因,bar基因为选择标记基因,构建了亚心型扁藻叶绿体同源整合载体pPSCG、pPSCB,用基因枪法将两个质粒导入亚心型扁藻细胞。通过流式细胞仪分选及激光共聚焦显微镜对观察到绿色荧光蛋白在叶绿体中的瞬间表达;转化质粒pPSCB的藻细胞经过草丁膦筛选,获得稳定转化子,检测到bar基因在亚心型扁藻叶绿体中的定点插入和稳定整合。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 第一节 亚心型扁藻的应用研究进展
• 1 亚心型扁藻生物学特征概述
• 2 亚心型扁藻的细胞形态与结构
• 3 亚心型扁藻的繁殖
• 4 亚心型扁藻的基础研究和应用价值
• 4.1 亚心型扁藻的培养
• 4.2 亚心型扁藻的多糖
• 4.3 亚心型扁藻产氢研究
• 4.4 渗透压
• 4.5 亚心型扁藻线粒体基因组
• 第二节 真核微藻基因工程研究进展
• 1 真核微藻细胞核转化系统
• 1.1 细胞核转化系统的载体元件
• 1.2 转化方法
• 1.3 转基因藻株的稳定遗传
• 2 真核微藻叶绿体转化系统
• 2.1 叶绿体基因组
• 2.2 叶绿体转化系统的特点
• 2.3 叶绿体遗传转化的原理
• 2.4 转化方法
• 3 真核微藻线粒体转化系统
• 第三节 本论文研究内容和意义
• 第二章 亚心型扁藻细胞核核转化系统的建立
• 第一节 亚心型扁藻的培养
• 1 材料与方法
• 1.1 藻株和培养条件
• 1.2 主要试剂
• 1.3 亚心型扁藻生长曲线测定
• 1.4 藻种纯化和保种
• 1.5 提取总基因组DNA
• 1.6 引物合成
• 1.7 PCR扩增
• 1.8 序列比对与分析
• 2 结果与讨论
• 2.1 亚心型扁藻生长曲线
• 2.2 亚心型扁藻基因组DNA的提取
• 2.3 亚心型扁藻分子标记的克隆和序列比对
• 3 结论
• 第二节 亚心型扁藻对不同选择压力的敏感性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 亚心型扁藻及培养方法
• 1.2 主要试剂
• 1.3 敏感性实验
• 2 结果与分析
• 2.1 亚心型扁藻对六种抗生素的敏感性
• 2.2 亚心型扁藻对除草剂草丁膦的敏感性
• 3 讨论
• 第三节 珠磨法介导绿色荧光蛋白在亚心型扁藻中的瞬间表达
• 1 材料与方法
• 1.1 藻种、菌种和培养方法
• 1.2 主要试剂
• 1.3 转化载体的制备
• 1.4 原生质体制备
• 1.5 珠磨法转化
• 1.6 绿色荧光蛋白的瞬间表达
• 2 结果与分析
• 2.1 制备原生质体
• 2.2 绿色荧光蛋白检测
• 3 讨论
• 第四节 草丁膦抗性基因在亚心型扁藻细胞核中的稳定表达
• 1 材料与方法
• 1.1 藻种、菌种及培养方法
• 1.2 主要试剂及仪器
• 1.3 转化质粒的制备
• 1.4 基因枪转化
• 1.5 珠磨法转化
• 1.6 筛选
• 1.7 亚心型扁藻基因组提取
• 1.8 PCR扩增bar基因
• 1.9 Southern杂交
• 2 结果
• 2.1 除草剂草丁膦筛选亚心型扁藻抗性转化子
• 2.2 PCR检测
• 2.3 探针浓度检测
• 2.4 Southern杂交
• 2.5 基因枪法和珠磨法转化效率的比较
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 第三章 亚心型扁藻叶绿体转化系统的建立
• 第一节 亚心型扁藻叶绿体基因组同源区的克隆
• 1 材料与方法
• 1.1 藻种、菌种及培养方法
• 1.2 亚心型扁藻基因组的提取
• 1.3 引物设计
• 1.4 PCR
• 1.5 PCR产物的克隆、测序
• 1.6 同源片段的拼接
• 2 结果与分析
• 2.1 亚心型扁藻基因组DNA的提取
• 2.2 亚心型扁藻叶绿体基因组片段PCR结果
• 2.3 PCR产物拼接
• 3 讨论
• 第二节 叶绿体转化载体的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 藻种、菌种及培养方法
• 1.2 主要试剂
• 1.3 亚心型扁藻基因组DNA的提取
• 1.4 引物设计
• 1.5 PCR扩增质粒片段
• 1.6 PCR产物的克隆、测序
• 1.7 制备质粒
• 1.8 构建亚心型扁藻叶绿体转化质粒
• 2 结果与分析
• 2.1 亚心型扁藻基因组DNA的提取
• 2.2 质粒片段的扩增结果
• 2.3 亚心型扁藻叶绿体表达载体
• 3 讨论
• 第三节 绿色荧光蛋白在亚心型扁藻叶绿体中的瞬间表达
• 1 材料与方法
• 1.1 藻种、菌种及培养方法
• 1.2 主要试剂及仪器
• 1.3 转化质粒的制备
• 1.4 基因枪转化
• 1.5 绿色荧光蛋白的检测
• 2 结果与分析
• 2.1 荧光显微镜观察结果
• 2.2 流式细胞仪分选
• 2.3 绿色荧光蛋白的亚细胞定位
• 3 讨论
• 第四节 草丁膦抗性基因在亚心型扁藻叶绿体的稳定表达
• 1 材料与方法
• 1.1 藻种、菌种及培养方法
• 1.2 主要试剂及配制方法
• 1.3 转化质粒的制备
• 1.4 基因枪转化
• 1.5 筛选
• 1.6 亚心型扁藻基因组提取
• 1.7 PCR检测
• 1.8 Southern杂交
• 2 结果
• 2.1 除草剂草丁膦筛选亚心型扁藻抗性转化子
• 2.2 基因组提取
• 2.3 PCR检测
• 2.4 探针浓度检测
• 2.5 Southern杂交
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 本文主要结论和创新性
• 参考文献
• 发表和完成论文情况
• 致谢