弓首蛔虫分子鉴定和线粒体基因组的研究

论文摘要

寄生于犬科和猫科动物的蛔虫属于弓首属（Toxocara）和弓蛔属（Toxascaris）,其中以犬弓首蛔虫和猫弓首蛔虫最为常见,它们的幼虫可以进入非特异宿主（包括人）的组织中,引起幼虫移行症,在公共卫生学上有重要意义。本研究的第一部分建立了弓首蛔虫和狮弓蛔虫种特异PCR鉴定方法,并将此方法应用于鉴定寄生于犬和猫的蛔虫种类。根据已经发表的弓首属和弓蛔属蛔虫核糖体DNA（rDNA）第1和第2内转录间隔区（ITS-1和ITS-2）核苷酸序列,分别设计出针对犬弓首蛔虫（YY1）、猫弓首蛔虫（JW4）、马来西亚弓首蛔虫（JW5）和狮弓蛔虫（YY2）4个种特异的上游引物,下游引物采用保守引物NC2。用这四对引物分别对四种蛔虫的总DNA进行PCR扩增,以期对这四种蛔虫在分子水平上进行种特异分类鉴定。结果显示,四对引物在优化的PCR条件下可以特异性地扩增出四种蛔虫rDNA中ITS-1和ITS-2部分序列,且在各虫种之间以及与牛弓首蛔虫、猪蛔虫、鸡蛔虫均无交叉反应。在敏感性试验方面,犬弓首蛔虫特异PCR试验可以检测到总DNA最低浓度为0.14ng/μl;猫弓首蛔虫、马来西亚弓首蛔虫和狮弓蛔虫分别可以检测到0.54ng/μl、0.38ng/μl和0.13ng/μl。ITS部分序列的测序结果验证了特异性PCR鉴定的有效性。该部分研究在国际上首次建立了用于弓首蛔虫和狮弓蛔虫分子鉴定的特异PCR方法,为弓首蛔虫成虫及组织中幼虫的鉴定以及人的弓首蛔虫病诊断奠定了基础。采用种特异PCR鉴定方法,对99个试验样品进行了检验。结果发现,在22个猫蛔虫样品中,有3个代表马来西亚弓首蛔虫、1个代表犬弓首蛔虫;在46个马来西亚弓首蛔虫样品中,有2个代表猫弓首蛔虫。应用上述鉴定方法,对采集于广州一只猫小肠内、形态与犬弓首蛔虫相似的线虫进行了分子鉴定,并测定了ITS-2序列,将序列与犬弓首蛔虫、猫弓首蛔虫、马来西亚弓首蛔虫的序列进行比较。结果显示,只有用马来西亚弓首蛔虫种特异性引物对试验虫体DNA进行扩增时,才能扩增出明显的DNA片段;试验虫体的ITS-2序列与马来西亚弓首蛔虫的相似性为100%,与猫弓首蛔虫的相似性为88.7%89.0%,与犬弓首蛔虫相似性为75.8%。结果表明,采自广州猫体、形态与犬弓首蛔虫相似的线虫为马来西亚弓首蛔虫。这是该种蛔虫在我国的首次发现,对研究我国弓首蛔虫病流行病学有重要意义。应用非同位素聚合酶链反应-单链构象多态性（Cold-SSCP）方法,首次分析了犬弓首蛔虫、猫弓首蛔虫、马来西亚弓首蛔虫和狮弓蛔虫的ITS-2核苷酸序列的差异。结果显示,四种蛔虫种间ITS-2序列带型差异明显,但种内则无明显差异。该方法与常规含同位素的SSCP方法比较,其检测的敏感性和图像效果相似,但有操作更简单、无同位素对人体的危害等优点,可以替代常规PCR-SSCP检测方法。本研究的第二部分应用PCR-SSCP和DNA序列分析方法,在国际上首次对犬弓首蛔虫、猫弓首蛔虫、马来西亚弓首蛔虫、牛弓首蛔虫和狮弓蛔虫的线粒体DNA（mtDNA）三个基因片段,即细胞色素c氧化酶亚基I （cox1）基因、烟酰胺脱氢酶亚基I（nad1）基因和烟酰胺脱氢酶亚基Ⅳ（nad4）基因进行多态性分析,为研究寄生虫分子分类、种群遗传关系和系统进化寻找更好的遗传标记。为研究弓首蛔虫及狮弓蛔虫种群内和种群间的序列差异、种群遗传关系和变异情况,该部分研究首先采用PCR-SSCP技术对犬弓首蛔虫、猫弓首蛔虫、马来西亚弓首蛔虫、牛弓首蛔虫和狮弓蛔虫cox1、nad1、nad4基因片断进行分析。SSCP分析结果发现,犬弓首蛔虫种群内三个基因片断SSCP带型变化都较小,而猫弓首蛔虫种群内三个基因片断SSCP带型变化较大,其余各种群内SSCP带型变化都很小或基本无变化。根据SSCP分析结果,在三个基因片段组中选择SSCP带型有差异的代表性样品共38个（其中cox1片断组12个、nad1片断组13个、nad4片断组13个）,经PCR扩增,产物经连接转化、克隆。取菌落PCR和质粒酶切鉴定均为阳性的克隆产物,送测序公司进行测序。测序结果显示,在线粒体cox1基因,犬弓首蛔虫种内cox1基因片段序列差异为2.1%3.7%,与猫弓首蛔虫、马来西亚弓首蛔虫、牛弓首蛔虫和狮弓蛔虫的种间序列差异分别为10.2%11.3%、9.7%12.2%、9.5%11.0%和10.0%12.9%;猫弓首蛔虫与马来西亚弓首蛔虫、牛弓首蛔虫和狮弓蛔虫种间序列差异分别为7.9%8.4%、8.0%和8.4%8.7%;马来西亚弓首蛔虫种群内cox1基因片段序列差异为0.2%0.9%,与牛弓首蛔虫和狮弓蛔虫的种间序列差异分别为8.5%8.7%和10.5%11.3%。在线粒体nad1基因,犬弓首蛔虫种内核苷酸序列差异为0.3%1.9%,与猫弓首蛔虫、马来西亚弓首蛔虫、牛弓首蛔虫和狮弓蛔虫的种间序列差异分别为11.0%14.1%、10.7%12.4%、12.6%13.7%和17.5%18.2%。猫弓首蛔虫种内nad1基因片段核苷酸序列差异为2.8%,与马来西亚弓首蛔虫、牛弓首蛔虫和狮弓蛔虫的种间序列差异分别为12.0%13.0%、15.1%和18.621.2%。马来西亚弓首蛔虫种内nad1基因核苷酸序列差异为0.0%0.3%,与牛弓首蛔虫和狮弓蛔虫的种间序列差异分别为12.4%12.8%和18.6%19.0%。在线粒体nad4基因,犬弓首蛔虫种内nad4的核苷酸序列差异为0.5%2.3%,与猫弓首蛔虫、马来西亚弓首蛔虫、牛弓首蛔虫和狮弓蛔虫种间序列差异分别为13.6%15.2%、15.9%17.6%、14.4%15.2%和20.1%21.9%;猫弓首蛔虫种内nad4的序列差异为1.0%,与马来西亚弓首蛔虫、牛弓首蛔虫、狮弓蛔虫序列差异分别是17.9%18.3%、13.0%14.3%和18.6%;马来西亚弓首蛔虫种群内nad4序列差异为0.0%0.3%,与牛弓首蛔虫、狮弓蛔虫序列差异分别为13.5%13.8%和20.7%21.0%。线粒体三个基因片段的PCR-SSCP和核苷酸序列分析结果表明,犬弓首蛔虫不同地方虫株的cox1、nad1、nad4基因序列有一定差异,显示较明显的多态性;猫弓首蛔虫cox1、nad1、nad4基因序列的种内差异较小;马来西亚弓首蛔虫cox1、nad1、nad4基因序列的种内差异很小,但与其它虫种之间的差异都较大,可以证明它确为一个独立的有效种。弓首属各虫种之间的差异都较大,但小于与狮弓蛔虫的种间的差异。结果还显示,样品Tcat2-2线粒体三个基因片段序列与犬弓首蛔虫差异较小,该样品代表犬弓首蛔虫;MTT1、Tcat1-1和Tcat1-2线粒体三个基因片段序列与马来西亚弓首蛔虫差异极小,它们代表马来西亚弓首蛔虫。线粒体基因序列分析的结果与种特异PCR鉴定结果一致。通过对线粒体cox1、nad1、nad4基因序列的多态性分析,显示这些基因均可作为弓首蛔虫和狮弓蛔虫理想的种特异遗传标记。线粒体DNA（mtDNA）是后生动物胞核外的遗传物质,它具有分子量小、结构简单、进化速度快、母性遗传等特点,是研究寄生虫分子分类、群体遗传、系统进化的一种很好的分子标记。线虫是动物界除昆虫外的最大动物群体,但是,迄今为止,只有不到十种寄生线虫mtDNA被完整或近完整测序,因此,对线虫mtDNA的了解还相当肤浅。为了填补线虫mtDNA的知识空白,本研究第三部分对犬弓首蛔虫mtDNA进行了完整测序。采用长PCR扩增方法,用引物对39F/42R和5F/40R分别扩增出长约5.5kb和9.5kb的两个mtDNA片段,送测序公司进行测序。测序结果分析显示,犬弓首蛔虫线粒体基因全长为14322bp。A+T含量为68.57%,是所有已知线虫线粒体基因组中最低的。基因组由12个蛋白质基因、2个rRNA基因、22个tRNA基因组成,缺乏基因atp8。最长非编码区（AT区）长985bp,在已知的多数线虫线粒体基因组中是最长的;第二非编码区（调控区）长111bp。各基因排序方式与猪蛔虫的完全一致;基因之内没有内含子;各基因之间没有基因间隔或有110个碱基的基因间隔。有2个tRNA基因（tRNA-Ile和tRNA-Ala）分别与蛋白质基因nad2和nad5重叠。在12个编码蛋白质的基因中,以TTG、ATT、ATA、GTT和ATG作为蛋白质翻译的起始密码子;多数蛋白质翻译的终止密码子为TAG,另外TAA、TA、T也作为终止密码子。犬弓首蛔虫mtDNA全序列的测定,不仅在国际上丰富了线虫线粒体基因组的研究内容,有着重大的学术意义,而且在研究寄生虫分子分类、种群遗传以及寄生虫防控等方面都有重要的意义。

论文目录

• 摘要
• 本论文常用英文缩写
• 前言
• 第一章 弓首蛔虫和狮弓蛔虫种特异PCR鉴定方法的建立和应用
• 第一节 弓首蛔虫和狮弓蛔虫种特异PCR鉴定方法的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 虫体样品
• 1.2 仪器和试剂
• 1.2.1 仪器
• 1.2.2 试剂和酶
• 1.2.3 溶液配制
• 1.3 引物的设计与合成
• 1.4 虫体总DNA 的提取和验证
• 1.4.1 虫体总DNA 的提取
• 1.4.2 虫体总DNA 的验证
• 1.5 特异 PCR 反应条件的优化
• 1.6 特异性实验
• 1.7 敏感性实验
• 1.8 序列分析
• 2 结果
• 2.1 PCR 试验条件的优化
• 2.2 PCR 扩增结果
• 2.3 特异性试验结果
• 2.4 敏感性试验结果
• 2.5 测序结果分析
• 3 讨论
• 第二节 非同位素SSCP 方法对弓首蛔虫和狮弓蛔虫ITS-2 序列的分析
• 1 材料与方法
• 1.1 虫体样品
• 1.2 仪器和试剂
• 1.2.1 主要仪器
• 1.2.2 主要试剂和溶液配制
• 1.3 虫体DNA 提取和PCR 扩增
• 1.3.1 虫体基因组DNA的提取
• 1.3.2 PCR 扩增
• 1.4 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SSCP 电泳）
• 2 结果与讨论
• 2.1 PCR 扩增
• 2.2 Cold-SSCP 分析
• 2.3 讨论
• 第三节 马来西亚弓首蛔虫在我国的首次发现
• 1 材料与方法
• 1.1 虫体的采集和处理
• 1.2 主要仪器和试剂
• 1.3 虫体基因组DNA的提取和特异PCR扩增
• 1.4 ITS 的 PCR 扩增和测序
• 1.5 虫体形态学观察
• 2 结果
• 2.1 形态学观察结果
• 2.2 特异PCR结果
• 2.3 ITS-2测序结果
• 3 讨论和小结
• 本章小结
• 第二章 弓首属和弓蛔属蛔虫线粒体cox1、nad1 和nad4 基因多态性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 虫体样品
• 1.2 仪器和试剂
• 1.2.1 主要仪器
• 1.2.2 试剂和酶
• 1.3 溶液和培养基的配制
• 1.3.1 溶液的配制
• 1.3.2 培养基的配制
• 1.4 感受态细胞
• 1.5 虫体总 DNA 的提取
• 1.6 线粒体DNA 三个基因片段的PCR 扩增
• 1.6.1 cox1 基因片段的PCR 扩增
• 1.6.2 nad1 基因片段的PCR 扩增
• 1.6.3 nad4 基因片段的PCR 扩增
• 1.7 非变性聚丙烯酰胺凝胶分析（SSCP 分析）
• 1.7.1 引物标记
• 1.7.2 SSCP分析
• 1.8 测序
• 1.8.1 PCR 产物的纯化和连接
• 1.8.2 重组质粒的转化及菌落PCR鉴定
• 1.8.3 质粒的小量抽提及酶切鉴定
• 1.9 DNA 序列分析
• 2 结果
• 2.1 PCR 扩增结果
• 2.2 PCR-SSCP 分析
• 2.2.1 cox1 基因PCR-SSCP 分析
• 2.2.2 nad1 基因PCR-SSCP 分析
• 2.2.3 nad4 基因PCR-SSCP 分析
• 2.3 测序结果
• 2.3.1 cox1 基因片断测序结果
• 2.3.2 nad1 基因片断测序结果
• 2.3.3 nad4 基因片断测序结果
• 2.4 DNA 序列分析结果
• 2.4.1 cox1 基因片断 DNA 序列分析结果
• 2.4.2 nad1 基因片断DNA 序列分析结果
• 2.4.3 nad4 基因片断 DNA 序列分析结果
• 3 讨论
• 3.1 cox1 基因多态性研究
• 3.2 nad1 基因多态性研究
• 3.3 nad4 基因多态性研究
• 3.4 线粒体三个基因序列上遗传标记位点比较
• 3.5 线粒体DNA三段基因序列种内和种间变异的分析
• 3.6 线粒体 DNA 序列作为遗传标记在虫种分类上的意义
• 本章小结
• 第三章 犬弓首蛔虫线粒体基因组全序列测序及序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 虫体样品
• 1.2 仪器和试剂
• 1.2.1 仪器
• 1.2.2 试剂和试剂盒
• 1.3 基因组 DNA 的抽提和验证
• 1.4 线粒体DNA 的长PCR 扩增
• 1.4.1 长 PCR 扩增引物
• 1.4.2 长 PCR 扩增条件
• 1.5 序列分析方法
• 2 结果和讨论
• 2.1 长PCR扩增结果
• 2.2 犬弓首蛔虫线粒体基因组总的特征
• 2.3 蛋白质编码基因和密码子使用模式
• 2.4 转移RNA（tRNA）基因
• 2.5 核糖体 RNA（rRNA）基因
• 2.6 非编码区
• 本章小结
• 全文总结
• 致谢
• 参考文献
• 英文摘要
• 附录 A 综述
• 附录B 质粒pGEM-T Easy Vector基因图谱
• 附录 C tRNA 二级结构
• 附录 D 在学期间发表论文、著作及参加科研课题情况