论文摘要
鸭瘟（Duck Plague, DP）,又称鸭病毒性肠炎（Duck Enteritis）,是由鸭瘟病毒引起的鸭、鹅和其他雁形目禽类动物发生的一种以血管损伤,组织出血,消化道黏膜糜烂,淋巴器官受损和全身实质性器官退行性病变为特征的急性、接触性、败血性传染病。鸭瘟病毒（Duck Plague Virus, DPV）,又称鸭肠炎病毒（Duck Enteritis Virus, DEV）,或鸭疱疹病毒1型（Anatid herpesvirus1, AnHV-1）,属疱疹病毒科未定种的疱疹病毒。本研究在实验室前期构建的DPV CHv毒株基因文库的基础上,首次发现并鉴定了DPVCHv株gD基因（GenBank登录号：EU195085）,并对gD基因开展系列研究,获得以下结果：1.鸭瘟病毒gD基因发现、克隆及生物信息学分析根据本实验室构建的DPV基因组文库,随机挑取文库中的重组质粒测序,并对测定的序列进行手工和计算机拼接,寻找病毒基因组的开放阅读框架（open reading frames, ORF）。拼接出的其中一个ORF1269采用多种网上生物信息学数据库及软件进行生物信息学分析。结果表明该ORF属疱疹病毒gD基因家族,为DPV的gD基因（GenBank登录号EU195085）。 gD基因完整编码区（ORF）全长1269bp,C+G共557bp,含量为44%。编码的gD蛋白含有422个氨基酸,分子量为47.5kD,理论等电点（PI）为6.66。进化树分析gD基因与与猫疱疹病毒-1型（FeHV-1）海豹疱疹病毒1型（PhoHV-1）以及犬疱疹病毒亲缘性较高；而gD蛋白与鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV、GaHV-1）的gD亲缘性最高。gD具有一个特征性的信号肽位于氨基酸序列1-22位；在7-29,360-382氨基酸之间有一跨膜区；gD蛋白主要定位于内质网中（44.4%）,其次在胞质、分泌小囊泡、生物膜外（包括细胞膜）、线粒体和细胞核中呈相同分布（11.1%）。gD有4个N-糖基化位点和9个O-糖基化位点。gD富含无规卷曲（Coil）,含量高达59.72%；其次为p-折叠（Strand）,含量为24.64%；而α-螺旋（Helix）含量较低占15.64%。2.鸭瘟病毒gD基因胞外区原核表达、产物纯化及其抗体制备根据发现的DPVgD基因序列,设计一对引物扩增DPV gD基因胞外区并将其克隆至pGEM-T载体中,经酶切和DNA测序鉴定正确后,将gD胞外区基因插入到pET32a载体的MscⅠ和HindⅢ之间,成功构建重组表达质粒pET32a-gD。将pET32a-gD转化感受态宿主菌E.coli BL21（DE3）, IPTG诱导后经SDS-PAGE电泳检测出大小约为30kD的重组蛋白,重组蛋白以可溶和不可溶包涵体两种形式表达。Western blot检测发现该蛋白能与DPV阳性血清发生特异性反应。大量表达gD蛋白,使用Ni-NTA亲和层析进行纯化,将纯化后的gD胞外区蛋白与弗氏佐剂混合后免疫家兔三次,使用ELISA方法测定血清中抗gD抗体滴度。抗gD抗体滴度可达1：256000；采集免疫家兔血清,使用Protein A亲和层析纯化收获抗gD蛋白抗体IgG,为后续研究奠定基础。3.鸭瘟病毒gD基因真核表达载体构建及在COS-7细胞中的瞬时表达根据DPVgD基因序列,设计一对特异引物,用PCR方法从DPV基因组中扩增目标基因全序列,将其正向插入真核表达载体pEGFP-N1和pcDNA3.1（+）多克隆位点NheⅠ和HindⅢ酶切位点之间,成功构建了重组真核表达质粒pEGFP-N1-gD和pcDNA3.1（+）-gD,脂质体介导转染至COS-7细胞中,采用激光共聚焦显微镜直接观察、Western-blotting及间接免疫荧光方法检测gD蛋白的表达。激光共聚焦显微镜下可见转染了pEGFP-N1-gD质粒的COS-7细胞质内及细胞膜上出现荧光蛋白的点状聚集现象,显示gD主要定位于细胞膜上。Western-blotting显示gD在COS-7细胞中表达产物的分子量为55KD左右,比gD预测分子量要大,为gD糖基化修饰后成熟糖蛋白；间接免疫荧光检测发现在COS-7细胞中的胞浆、核内及细胞膜上均出现荧光蛋白的点状聚集现象,显示gD主要定位于细胞膜上4.鸭瘟病毒gD基因的转录及表达分析及gD蛋白在宿主细胞中的亚细胞定位研究常规方法制备鸭胚成纤维细胞,细胞长成单层后,接种病毒DPV CHv株,分别于接毒后Oh（未接毒细胞,空白对照组）、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h、60h采集样品,进行（1）细胞总RNA提取；（2）细胞总蛋白提取,（3）细胞固定。分别进行（1）荧光定量PCR检测gD基因转录时相；（2） Western-blotting检测gD蛋白表达时相；（3）间接免疫荧光检测gD亚细胞定位。结果表明：DPVgD基因在病毒感染鸭胚成纤维细胞后2h开始转录,8h开始表达,12h后转录量和表达量迅速增加后稍下降但仍维持较高水平至60h；该基因在DEF细胞中的表达产物呈现高丰度现象,主要为分子量55Kd的成熟糖蛋白.而gD蛋白在DEF细胞中的定位是一个动态变化过程,最早在接种后8h观察到定位于胞浆,12h见除胞浆外还定位于细胞核膜上,24h主要定位于细胞膜,48h在细胞核核膜、细胞膜及胞浆中均有定位。持续至60h后由于细胞融合崩解至定位不规则。该定位特征与疱疹病毒糖蛋白相同。检测到的时相定位与疱疹病毒糖蛋白的合成过程及定位基本相似,证实了DPVgD功能与其他疱疹病毒gD功能的相似性。5. DPV gD胞外区蛋白作为包被抗原检测鸭瘟抗体间接ELISA建立和应用本试验以pET32a为载体原核表达的重组DPVgD蛋白作包被抗原,进行间接ELISA检测DPV抗体的研究；并对该方法进行了优化和应用。采用方阵滴定实验确定重组表达蛋白与血清的最佳稀释度,最适包被重组抗原蛋白浓度为100ng/孔（1μg/mL,100μL/孔）包被后37℃1h,然后于4℃条件下过夜,最佳血清稀释度为1：80，0.5%的明胶PBST作封闭液,阴阳性的临界值（cut off值）为阴性样本OD值的平均值（x）+3SD。用建立的间接ELISA检测方法对收集到的DPV阳性血清、DHBV阳性血清、DHV阳性血清以及GpV阳性血清作1：80稀释,ELISA测定发现其只与DPV阳性血清发生反应。与本室自制的DPV全病毒ELISA试剂盒平行检测临床样本血清90份,吻合率为94%,检出率差异不显著。结果表明建立的gD-ELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性,可以用于DPV感染的诊断和疫苗免疫后的抗体监测。6.基于DPV gD基因的PCR检测方法建立和应用依据DPV gD基因无信号肽片段序列设计引物,建立了检测DPVgD基因PCR方法并进行了应用。特异性试验中,从正常DEF细胞、鸭胚尿囊液及DHV. DHBV. GpVDNA中均未扩增出阳性条带,同时对同为疱疹病毒的HSV-1, HSV-2和BV来说,可从病毒DNA中能扩增出条带,说明了gD蛋白在同科病毒中的同源性,而扩增出的片段大小并不与gD基因预计扩增片段大小相同,说明了gD基因PCR引物及方法的特异性；敏感性试验结果显示能检测出lpg左右的DPV DNA;应用该PCR方法对DPV感染病料肝脏、脾脏、胸腺、淋巴结和法氏囊等免疫相关器官组织进行检测,均能扩增出与预期大小一致以及序列吻合的特异性条带,正常组织中未检出阳性条带。证实该方法可应用于临床DPV的检测。
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