家蚕脂肪体组织蛋白质表达差异分析及利用转基因技术构建抗BmNPV家蚕品种的探索

论文摘要

家蚕（Bombyx mori）脂肪体（fatbody）既是营养物质储存和能量供给的器官,又是一个重要的物质代谢和解毒器官,脂肪体蛋白质组的研究有利于揭示脂肪体在家蚕新陈代谢中的作用机理。家蚕核型多角体病毒病是蚕桑生产的重大疾病,抗核型多角体病毒家蚕品种的培育是防止家蚕核型多角体病毒病的最经济最有效的途径。本研究采用秋丰、白玉和秋丰×白玉3个家蚕品种为材料,用0min,10min,1h,]d和3d共5种时间类型的40℃高温热激处理,探讨了家蚕脂肪体组织蛋白质组表达情况,以期在蛋白质水平了解不同家蚕品种在不同时间热激条件下的生理反应。研究采用蛋白质双向电泳技术,对脂肪体蛋白质组在不同时期的匹配分析结果表明,秋丰有81个蛋白斑点、白玉有105个蛋白斑点,秋丰×白玉有88个蛋白斑点具有表达差异,表达变化趋势都可归结为5个大类。经基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱联用的质谱方法鉴定获得7种8个蛋白,分别是：原肌球蛋白异构体5、2个α-晶体蛋白、组成型热激蛋白HSC70、肌动蛋白异构体Actin57B、肌动蛋白异构体Actin 5C、蛋白RE12057p和蛋白LD04994p。原肌球蛋白是肌肉收缩过程中重要的调节蛋白质,它能与肌动蛋白肌丝相结合,发挥对肌肉收缩的调节作用。本研究鉴定出了2种不同时期差异表达的肌动蛋白Actin 57B和Actin 5C,并且发现它们的表达趋势皆为上调,推测高温热激处理可能增强了家蚕的活动性,所以进一步激活或促进了与家蚕运动相关的肌动蛋白等的表达。采用Pro-Q Diamand荧光染料染色的研究磷酸化蛋白的方法,对秋丰、白玉、秋丰×白玉不同时间热激处理的磷酸化蛋白分析表明,磷酸化蛋白质总体的变化规律为：高温热激处理0min的家蚕其磷酸化蛋白数量较少,热激处理10min后其蛋白数量迅速升高,热激处理1h时达到最高,热激处理3d后磷酸化蛋白数量迅速减少。实验中鉴定出了5种蛋白：p-微管蛋白（beta-tubulin）、氢离子转运ATP合成酶β亚基异构体Ⅱ（H+transporting ATP synthase beta subunit isoform 2）、核糖体蛋白P0（ribosomal protein P0）、小热激蛋白21.4（small heat shock protein, sHSP21.4）和钙网蛋白（calreticulin）,其在3个家蚕品种、五个处理时期的变化规律具有相似之处。我们还通过显微注射含有A3肌动蛋白启动子和EGFP标志基因的piggyBac转座子质粒（pPIGA3GFP）,利用其随机插入家蚕基因组的特点初步改变了家蚕的基因组的结构,研究表明piggyBac转座子的随机插入可以改变转基因家蚕对BmNPV的抗性,与秋丰相比抗性最高可提高33个百分点。将转基因家蚕结合育种方法杂交获得2个杂交组合,与生产用品种秋丰×白玉进行抗BmNPV和生产性能比较试验,结果表明春花×秋月正反交平均比秋丰×白玉正反交抗病性提高了10.28个百分点。结果暗示了采用piggyBac转座子随机插入家蚕基因组以改变中肠的特性,进一步获得抗BmNPV家蚕品种的可行性。

论文目录

• 目录
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一篇 文献综述
• 第1章 家蚕蛋白质组学研究
• 1. 热激蛋白研究
• 1.1 热激蛋白的分类及简介
• 1.2 热激蛋白功能
• 1.3 家蚕热激蛋白相关研究
• 2. 磷酸化蛋白研究
• 2.1 蛋白磷酸化修饰的形式及研究手段
• 2.2 磷酸化修饰的功能及意义
• 2.3 磷酸化修饰蛋白的研究进展
• 3. 家蚕中肠蛋白质研究
• 第2章 家蚕脂肪体组织研究
• 1. 脂肪体分布和组成
• 2. 脂肪体的生理功能
• 2.1 家蚕脂肪体的免疫功能
• 2.2 脂肪体组织在家蚕发育变态中的重要作用
• 3. 家蚕脂肪体蛋白质组研究
• 第3章 家蚕品种与BmNPV
• 1. BmNPV的理化特性
• 2. 家蚕与BmNPV抗性
• 第二篇 实验研究
• 第4章 家蚕脂肪体组织蛋白质表达差异分析
• 1. 研究的目的意义及主要研究内容
• 2. 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 家蚕
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 家蚕脂肪体组织的获取
• 2.2.2 组织总蛋白的提取及浓度测定
• 2.2.3 双向电泳过程
• 2.2.4 染色及胶的扫描
• 2.2.5 软件分析
• 3. 实验结果与分析
• 3.1 家蚕脂肪体组织不同处理的蛋白电泳图谱分析
• 3.2 蛋白匹配分析
• 3.3 家蚕品种秋丰在不同热激阶段的总蛋白表达分析
• 3.3.1 品种秋丰热激处理后各期均表达的差异蛋白表达分析
• 3.3.2 品种秋丰热激处理后部分时期表达的差异蛋白表达分析
• 3.4 家蚕品种白玉在不同热激阶段的总蛋白表达分析
• 3.4.1 品种白玉热激处理后各期均表达的差异蛋白表达分析
• 3.4.2 品种白玉热激处理后部分时期表达的差异蛋白表达分析
• 3.5 家蚕品种秋丰×白玉在不同热激阶段的总蛋白表达分析
• 3.5.1 品种秋丰×白玉热激处理后各期均表达的差异蛋白表达分析
• 3.5.2 品种秋丰×白玉热激处理后部分时期表达的差异蛋白表达分析
• 3.6 质谱鉴定结果及分析
• 4. 讨论
• 第5章 家蚕脂肪体组织蛋白磷酸化分析
• 1. 研究的目意义及主要内容
• 2 实验材料与方法
• 2.1 家蚕品种
• 2.2 试剂
• 2.3 仪器
• 2.4 实验方法
• 3. 实验结果与分析
• 3.1 磷酸化蛋白电泳胶图
• 3.2 凝胶电泳图分析及数据处理
• 3.2.1 种内热激处理不同时间的磷酸化蛋白匹配分析
• 3.2.2 相同时间热激处理的品种间磷酸化蛋白匹配分析
• 3.3 相同家蚕品种不同热激阶段的磷酸化蛋白表达及变化分析
• 3.3.1 家蚕品种秋丰不同热激阶段的磷酸化蛋白表达及变化分析
• 3.3.2 家蚕品种白玉不同热激阶段的磷酸化蛋白表达及变化分析
• 3.3.3 家蚕品种秋丰x白玉不同热激阶段的磷酸化蛋白表达及变化分析
• 3.4 相同热激处理时间秋丰、白玉、秋丰×白玉磷酸化蛋白的表达分析
• 3.4.1 热激处理0min时表达的磷酸化蛋白点分析
• 3.4.2 热激处理10min时表达的磷酸化蛋白点分析
• 3.4.3 热激处理1h时表达的磷酸化蛋白点分析
• 3.4.4 热激处理1d表达的磷酸化蛋白点分析
• 3.4.5 热激处理3d表达的磷酸化蛋白点分析
• 3.5 质谱结果分析
• 4. 讨论
• 第6章 转基因技术构建抗BmNPV家蚕品种的探索
• 1. 试验研究方案及目的意义
• 1.1 试验方案
• 1.2 研究目的意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 显微注射蚕卵和转基因家蚕的筛选
• 2.3 转基因家蚕BmNPV抗性比较试验
• 3. 试验结果及分析
• 3.1 转基因家蚕的获得
• 3.2 试验中所观察到的荧光家蚕类型
• 3.3 转基因家蚕BmNPV抗性比较结果
• 3.4 抗BmNPV家系杂交组合选育
• 4. 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表的学术论文
• 附录1
• 附录2
• 附录3